Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

100
VP1-CallS-T248C-Kapsomere wurden an Cystein 248 mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Texas Red markiert. Der überschüssige Fluoreszenzfarbstoff wurde durch Dialyse
entfernt. Die markierten Kapsomere wurden unter Standardbedingungen in vitro
assembliert. Zur Abtrennung feiner Schwebteilchen oder Proteinaggregaten wurden die
Lösungen für 30 min bei 13000 ×g zentrifugiert. Sowohl Proben des nicht-assemblierten
als auch des assemblierten Proteins wurden am Durchfluss-Zytometer vermessen. Es
konnten Populationen von freien Kapsomeren und auch von Kapsiden detektiert werden
(Abbildung 47). In guter Übereinstimmung zu den HPLC-Gelfiltrations-
Chromatographie-Daten wurde in der assemblierten Probe mittels Durchfluss-
Zytometrie ein Verhältnis von 60 % Kapsiden zu 40 % Kapsomeren gemessen, was der
maximalen Assemblierungseffizienz einer cysteinfreien in vitro-Assemblierung
entsprach; in der nicht-assemblierten Probe wurden nahezu ausschließlich Kapsomere
detektiert.
Es war bislang nicht bekannt, dass derartig kleine Partikel mit Durchmessern unter
50 nm von Durchfluss-Zytometern detektiert werden können. Allerdings ist eine relativ
hohe Signalverstärkung notwendig, was unter Umständen zu einem starken
Signalrauschen führen kann. Daher war die Verwendung reinster Chemikalien und eine
Zentrifugation der Probe vor der Messung unbedingt notwendig. In den hier
beschriebenen Messungen ergaben jedoch weder der verwendete Puffer noch eine
verdünnte Lösung des freien Farbstoffes ein Messsignal.
Die Möglichkeit einer Detektion von fluoreszenzmarkierten Proteinassoziaten im
Nanometerbereich bietet eine potentielle Anwendung in der medizinischen Diagnostik.
Vor allem bei neuronalen Erkrankungen, wie Alzheimer oder Creutzfeld-Jakob-
Krankheit, tritt eine Aggregation von Proteinfragmenten oder Peptiden auf (Cappai &
White, 1999, Eigen, 1996), so dass eine Mischung entsprechender Gewebeproben aus
Patienten mit einem geeigneten fluoreszenzmarkierten Peptid unter entsprechenden
Bedingungen eine Analyse und Diagnostik mit Durchfluss-Zytometrie ermöglichen
könnte. Vorteile dieses Systems wären vor allem ein hoher Probendurchsatz und eine
bereits vorhandene weite Verbreitung von Durchfluss-Zytometern in der medizinischen
Analytik (Böhm & Schmidt, 1999).