Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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erfolgte mit Standardproteinen. Elutionsvolumina für Kapsomere wurden mit dem
Protein VP1-ΔC61 bestimmt. Als Kapsidprobe wurde zur Eichung eine VP1-wt-Probe
verwendet, in der Kapside elektronenmikroskopisch nachgewiesen wurden. Die
Eichung der Säulen ist in Tabelle 17 zusammengefasst.
Tabelle 17. Eichung der Gelfiltrationssäulen TSK-Gel 5000PWXL und TSK-Gel 6000PWXL, das
Säulenvolumen betrug jeweils 14 ml
Protein
VP1-Pentamer
VP1-Kapsid
Urease-Hexamer
Urease-Trimer
BSA-Monomer
Hühnereiweiß-Albumin
α-Lactalbumin
Molekularmasse
Elutionsvolumen [ml]
[kDa] 5000PWXL 6000PWXL
212.5
15300
545.0
272.0
66.0
45.0
14.2
9.4
6.7
8.7
9.4
10.1
10.2
10.3
11.6
8.8
11.4
11.6
> 12.0
> 12.0
> 12.0
Für kleinere Proteine mit Molekularmassen von weniger als 200 kDa reichte die
Auflösung der TSK-Gel 6000PWXL nicht mehr zu einer reproduzierbaren Auftrennung
aus. Im hochmolekularen Bereich waren jedoch beide Säulen gleichermaßen für eine
Auftrennung von VP1-Kapsiden und Kapsomeren geeignet.
3.2.5 Vergleich der Assemblierung von VP1-wt, VP1-CallS und VP1-2C
VP1-wt, VP1-CallS und VP1-2C wurden unter Zusatz von CaCl2 durch Dialyse in vitro
assembliert (Salunke et al., 1989). Mit Hilfe von Gelfiltrations-Chromatographie
wurden die Proben analysiert (Abbildung 29). Die Kapsid-Peaks wurden jeweils
gesammelt und elektronenmikroskopisch untersucht (Abbildung 29). In allen Kapsid-
Peaks wurden durch Elektronenmikroskopie Kapside nachgewiesen, so dass von einer
korrekten Eichung der Säulen ausgegangen werden konnte.
Zwischen den VP1-wt und VP1-2C Proben konnte kein Unterschied detektiert werden.
Die Assemblierungseffizienz lag jeweils bei 100 %, und im Elektronenmikroskop
zeigten sich Partikel mit der erwarteten Größe von etwa 50 nm (Abbildung 29). Im
Gegensatz dazu assemblierte VP1-CallS nur zu 55 %. Auch eine Verlängerung der
Assemblierungsdauer oder der Zusatz von Ammoniumsulfat bei der Assemblierung
konnte keinen höheren Kapsidanteil liefern. Im Elektronenmikroskop wurden ebenfalls
VP1-CallS-Kapside der erwarteten Größe detektiert, zusammen mit partiell
dissoziierten Partikeln (Abbildung 29).