Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Transformation von E. coli verwendet, wobei die verbleibenden Einzelstrangbrüche in
der synthetisierten DNA geschlossen wurden.
Abbildung 7. Prinzip der ortsgerichteten Mutagenese.
Die Synthese des Plasmids mit der veränderten Sequenz erfolgte im 25 µl-Maßstab. Ein
typischer Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
10× Pfu-Polymerase Puffer
Templat-DNA (50-100 ng/µl)
dNTP-Mix (100 mM)
Oligonukleotid 1 (20 pmol/µl)
Oligonukleotid 2 (20 pmol/µl)
Wasser
Pfu-DNA-Polymerase (3 U/µl)
Es wurde folgendes Temperaturprogramm verwendet:
2.5 µl
1.0 µl
0.5 µl
1.0 µl
1.0 µl
18.5 µl
0.5 µl
Vorgang Temperatur Dauer Zyklen
Initiale Denaturierung 95 °C 30 s 1
Denaturierung
Annealing
Extension
lineare
Amplifikation
* Extensionszeit nach Templat-Größe: 2 kb/min
95 °C
52 °C
68 °C
30 s
60 s
600-1200 s *
Danach wurden 0.5 µl Dpn I (10 U/µl) zugegeben und für 1 h bei 37 °C und für 10 min
bei 65 °C inkubiert. Mit 2 µl des Ansatzes wurden E. coli TOP10-Zellen transformiert.
Geräte
Thermocycler: Mastercycler gradient (Eppendorf)
Dpn I Verdau
Enzyme
Pfu-DNA-Polymerase (Promega), Dpn I (New England Biolabs)
18
33