Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

40
PAA 30
4× Nativ-Sammelgelpuffer
Wasser
TEMED
APS-Lösung
2 ml
2 ml
5.9 ml
10 µl
100 µl
Die Proben wurden mit mindestens 25 % ihres Volumens mit Probenpuffer versetzt und
für 5 min auf 98 °C erhitzt. Die Elektrophorese lief in Tris/Glycin-Puffer bei 35 mA pro
Gel und war nach 50 bis 60 min beendet. Die Gele wurden dann zunächst 10 min in
PAGE-Fixierer fixiert und dann 30 min mit PAGE-Färber gefärbt. Anschließend
wurden sie in 10 % (v/v) Essigsäure gelagert.
Die Bestimmung der Molekularmasse erfolgte durch einen nativen Proteinstandard und
Auswertung über Ferguson Plots (Ferguson, 1964). Dazu mussten zur Erstellung einer
Eichgerade, Trenngele unterschiedlicher Konzentration verwendet werden.
Geräte
Vertikal-Elektrophoresekammer: Mighty Small SE200 (Hoefer), Netzteil: EPS-200
(Pharmacia)
Puffer und Lösungen
PAA30 (30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid, Roth), 4× Nativ-Trenngelpuffer, 4×
Nativ-Sammelgelpuffer, TEMED (Roth), APS-Lösung (Ammmoniumperoxodisulfat,
gesättigt), 10× Nativ-Tris/Glycin-Puffer (15 g Tris-Base, 72 g Glycin, pH stellt sich
ein), Probenpuffer, PAGE-Fixierer (10 % (v/v) Essigsäure, 25 % (v/v) Isopropanol),
PAGE-Färber (10% Essigsäure, 0.006 % Coomassie Brilliant Blue G250), 10 % (v/v)
Essigsäure
2.2.8 Western-Blot
Bei einem Western-Blot werden Proteine zuerst durch SDS-PAGE aufgetrennt,
elektrophoretisch auf eine Membran übertragen und dort mit einem spezifischen
Antikörper inkubiert. Die anschließende Behandlung mit einem sekundären Antikörper
und Aktivierung der gekoppelten Peroxidase ermöglicht einen spezifischen
Proteinnachweis durch einen Farbniederschlag oder Chemilumineszenz (Coligan et al.,
1995).
Zum spezifischen Nachweis von VP1 bzw. Intein wurde das Protein von einem
12 %igen SDS-Gel auf eine PVDF-Membran geblottet (Gültekin & Heermann, 1988).
Das Gel wurde auf eine mit Methanol äquilibrierte PVDF-Membran gelegt und
zwischen zwei Stapel aus je drei Filterpapieren, die zuvor in 1× Tris/Glycin-Puffer mit
20 % (v/v) Methanol vorinkubiert worden waren, gebracht. Dieser Stapel wurde in eine
Semi-Dry-Blotting Apparatur gelegt. Der Blot erfolgte für 1 h bei einer konstanten
Stromstärke von 100 mA. Nach dem Blot wurde die Membran in Ponceau-Lösung
gefärbt und der mitgeführte Molekularmassenmarker für einen späteren
Größenvergleich gekennzeichnet. Die Ponceau-Färbung wurde durch kurzes Spülen mit
Wasser wieder entfernt. Anschließend wurde die Membran in 1× TBT-Puffer mit 5 %