Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

3.5 Insertion eines RGD-Motivs in die VP1-Sequenz
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Ideale Gentherapie-Vektoren sollten neben einem effizienten Gentransfer auch einen
gerichteten Transfer in das Zielgewebe ermöglichen, so dass bei einer systemischen
Administration der Vektor an den Wirkungsort dirigiert wird (Peng & Russel, 1999).
Eine relativ einfache Möglichkeit den Tropismus eines Vektors zu verändern oder zu
erweitern, stellt die Insertion kurzer Peptide dar. Eine der kleinsten bekannten
Sequenzen, die eine Rezeptorbindung ermöglichen ist die Aminosäurenabfolge Arginin-
Glycin-Aspartat (RGD), die eine Bindung an zahlreiche zelluläre Integrinrezeptoren
erlaubt (Ruoslahti, 1996). Die Insertion eines RGD-Motivs in virale
Oberflächenproteine konnte beispielsweise die Gentransfereffizienz mit
Adenovirusvektoren in Zelltypen steigern, die nicht den primären Adenovirusrezeptor
exprimieren (Wickham et al., 1997, Vigne et al., 1999, Reynolds et al., 1999). Auch bei
Adeno-assoziierten Viren konnte der Zelltropismus durch die Insertion einer RGD-
Sequenz erweitert werden (Girod et al., 1999). Nicht-virale Gen-Transfer-Systeme
können ebenfalls mit Hilfe von RGD-Peptiden an Integrinrezeptoren dirigiert werden;
Peptide, die sowohl ein RGD-Motiv als auch eine Sequenz zur DNA-Bindung tragen,
konnten zum Delivery von Antisense-Oligonukleotiden verwendet werden (Bachmann
et al., 1998). Von einigen Viren ist bekannt, dass ihre Aufnahme natürlicherweise von
einer Bindung viraler RGD-haltiger Proteine an Integrinrezeptoren abhängt. Dazu
gehören Adenoviren (Huang et al., 1995), Maul- und Klauenseuche-Virus (Lea et al.,
1995) und Coxsackie-Viren (Roivainen et al., 1994).
Der Zelltropismus von Maus-Polyomavirus hängt von dem verwendeten Stamm und
damit von der VP1-Sequenz ab. Der large plaque-Stamm repliziert sich vor allem in der
Lunge und in der Niere, aber auch in Knochen und in der Haut, wohingegen der small
plaque-Stamm auf Lungengewebe beschränkt ist (Dubensky et al., 1991). Diese
Selektivität hängt wahrscheinlich nicht ausschließlich von den VP1-
Rezeptorbindungseigenschaften ab, da diese Unterschiede in vitro in Zellkulturen
praktisch keine Rolle spielen (Dawe et al., 1987).
Hier wurde versucht, durch die Insertion eines RGD-Motivs die Aufnahme von
Polyomavirus-analogen Kapsiden in Zellen zu verbessern, die eine erhöhte Zahl von
Integrinrezeptoren besitzen. Gleichzeitig sollte durch die Insertion an verschiedenen
Stellen innerhalb der VP1-Sequenz ermittelt werden, welche Positionen für
Sequenzinsertionen geeignet sind.
3.5.1 Herstellung der Proteine VP1-1RGD150 und VP1-1RGD292
Für die Insertion von RGD-Sequenzen wurden die Positionen 150 und 292 innerhalb
der VP1-Sequenz gewählt. Diese befinden sich in Loop-Regionen auf der VP1-
Aussenseite. Das RGD-Motiv wurde jeweils von Linkern, bestehend aus flexiblen
Serin-Glycin-Abfolgen, flankiert, um eine gute Exposition des Motivs zu gewährleisten.
Ein Modell des Proteins VP1-1RGD150 ist in Abbildung 48 dargestellt.