Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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2.1.7 Dephosphorylierung von DNA-Enden
Die Dephosphorylierung von 5‘-DNA-Enden wird von dem Enzym Alkalische
Phosphatase (CIP) katalysiert. Diese Reaktion ist wichtig, um bei Klonierungen in einen
linearisierten Vektor mit kompatiblen Enden eine Selbstligation des Vektors als
dominante Nebenreaktion zu verhindern.
Die Dephosphorylierung erfolgte immer direkt nach einer präparativen Spaltung mit
Restriktionsendonukleasen. Da die Alkalische Phosphatase in allen Puffern der
Restriktionsenzyme aktiv ist, wurde dem Ansatz 1 µl CIP (1 U/µl) zugegeben. Die
Reaktionsmischung wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert und für 10 min bei 65 °C
hitzeinaktiviert.
Enzyme
CIP: Alkalische Phosphatase aus Kälberpankreas (New England Biolabs)
2.1.8 DNA-Ligation
Mit Hilfe von T4-DNA-Ligase werden DNA-Enden unter ATP-Hydrolyse kovalent
miteinander verknüpft. Mindestens ein 5‘-Ende der DNA muss dabei phosphoryliert
sein. Ein typischer 10 µl-Ligationsansatz setzte sich folgendermaßen zusammen:
10× T4-DNA-Ligase-Puffer
Fragment 1/Vektor (20-50 ng/µl)
Fragment 2 (50 ng/µl)
Wasser
T4-DNA-Ligase (400 U/µl)
1.0 µl
1.0-3.0 µl
2.0-4.0 µl
1.0-5.0 µl
1.0 µl
Für die Ligation zweier Fragmente zu einem linearen DNA-Strang wurden diese
äquimolar eingesetzt; für die Insertion eines Fragmentes in einen Vektor wurde das
Fragment mindestens in einem 4-fachen molaren Überschuss zum Vektor eingesetzt.
Der Reaktionsansatz wurde für 1-16 h bei 16 °C inkubiert.
Geräte
Thermoblock: Thermomixer comfort (Eppendorf)
Enzyme
T4-DNA-Ligase (New England Biolabs)
Puffer und Lösungen
10× T4-DNA-Ligase-Puffer (New England Biolabs)
2.1.9 Phosphorylierung von Oligonukleotiden
Eine Phosphorylierung an 5‘-DNA-Enden wird unter ATP-Hydrolyse von dem Enzym
Polynukleotidkinase katalysiert. 5‘-Phosphatgruppen sind für eine Ligation von DNA-