Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Das Plasmid pCYB-VP1 diente als Templat für eine zweite PCR mit den
Oligonukleotiden VP1-NdeI-5‘ und Intein-EcoRI-3‘. Bei dieser PCR wurde das
gesamte Fusionsprotein VP1-Intein-CBD amplifiziert. Wiederum wurden Schnittstellen
für die Restriktionsenzyme Nde I und Eco RI eingeführt, über die eine Klonierung in
das Plasmid pET21a erfolgte (Abbildung 13). Der daraus resultierende Vektor pET21-
VP1Int besaß einen T7lac-Promotor zur Expression des Fusionsproteins.
Beide Plasmide wurden auf eine korrekte Insertion des VP1-Gens mit Hilfe von
Restriktionsanalysen überprüft. Außerdem erfolgte eine DNA-Sequenzierung mit dem
Oligonukleotid VP1NImp, bei der die fehlerfreie VP1-Sequenz in beiden Plasmiden
nochmals bestätigt wurde.
3.1.2 Optimierung der Expression und Reinigung
Für Versuche zur Expression von VP1 wurden mit dem Plasmid pCYB-VP1 E. coli XL-
1 blue und DH5α und mit pET21-VP1Int E. coli BL21(DE3) transformiert. Nach der
Induktion mit 1 mM IPTG wurden die Kulturen für 4 h bei 30 °C geschüttelt. Nach
dieser Zeit und unmittelbar vor der Induktion wurden jeweils Proben entnommen, die
durch SDS-PAGE analysiert wurden. In keinem Fall konnte eine Zunahme des
Fusionsproteins beobachtet werden, unabhängig von dem verwendeten Plasmid und
dem Expressionsstamm (Abbildung 14). Nach einem Zellaufschluss konnte aus dem
Rohextrakt ebenfalls kein Fusionsprotein an Chitinbeads gebunden werden, so dass
nach Spaltungsinduktion mit 50 mM DTT kein eluiertes VP1 nachgewiesen werden
konnte.
M 1 2 3 4 5 6
100 kDa VP1-Intein-CBD
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
20 kDa
10 kDa
Abbildung 14. SDS-PAGE zum Expressionstest des VP1-Intein-CBD-Fusionsproteins.
Aufgetragen sind jeweils gesamte Zellen: XL1 blue/pCYB-VP1 vor Induktion (1) und 3 h nach
Induktion und Schütteln bei 30 °C (2); DH5α/pCYB-VP1 vor (3) und nach Induktion (4);
BL21(DE3)/pET21-VP1Int vor (5) und nach Induktion (6).
Die Proben wurden weiterhin durch Western-Blot mit Anti-VP1- und Anti-Intein-
Antikörpern untersucht, um auch geringe Mengen des Fusionsproteins spezifisch
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