Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Enden erforderlich. Ein typischer 20 µl-Phosphorylierungsansatz setzte sich wie folgt
zusammen:
10× T4-DNA-Ligase Puffer
DNA-Lösung
Wasser
Polynukleotidkinase (0.5 U/µl)
2.0 µl
10.0-17.0 µl
0-7.0 µl
1 µl
Der Ansatz wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend für 10 min bei 65 °C
hitzeinaktiviert.
Enzyme
Polynukleotidkinase (New England Biolabs)
Puffer und Lösungen
10× T4-DNA-Ligase-Puffer (New England Biolabs)
2.1.10 Polymerase-Kettenreaktion
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion lässt sich durch eine sich zyklisch
wiederholende Abfolge von Reaktionsschritten ein DNA-Segment amplifizieren, das
von bekannten Sequenzen begrenzt wird (Mullis et al., 1986, Saiki et al., 1988,
Lachmund & Sachse, 1994)).
Die PCR wurde sowohl zur analytischen Amplifikation bestimmter Gensegmente als
auch zur präparativen Amplifikation von Genen verwendet. Analytische Ansätze
wurden mit Taq-DNA-Polymerase durchgeführt, präparative Ansätze aufgrund der
geringeren Fehlerrate mit Pfu-DNA-Polymerase. Ein typischer 50 µl-Ansatz setzte sich
wie folgt zusammen (analytische Ansätze wurden analog im 10 µl Maßstab
durchgeführt):
10× Polymerase Puffer
Templat-DNA (5-50 ng/µl)
dNTP-Mix (100 mM)
5‘-Oligonukleotid (20 pmol/µl)
3‘-Oligonukleotid (20 pmol/µl)
Wasser
Pfu-/Taq-DNA-Polymerase (3 U/µl)
Es wurde folgendes Temperaturprogramm verwendet:
5.0 µl
1.0 µl
0.8 µl
2.0 µl
2.0 µl
38.2 µl
1.0 µl
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