Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im
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Probenvorbereitung<br />
Zur Messung am Durchfluss-Zytometer wurden die Zellen einer 35 mm-Petrischale<br />
nach Aufnahmeexper<strong>im</strong>enten oder Expressionsexper<strong>im</strong>enten mit PBS gewaschen,<br />
trypsiniert, in 2 ml Medium resuspendiert und in ein 5 ml FACS-Röhrchen überführt.<br />
Anschließend wurde für 5 min bei 800 ×g zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit<br />
PBS gewaschen und dann unter Rühren mit einem Vortex-Rührer in 3 ml<br />
Paraformaldehyd-Lösung resuspendiert. Nach 30 min Inkubation wurden die fixierten<br />
Zellen erneut zentrifugiert (5 min, 800 ×g) und abschließend in 2 ml PBS resuspendiert.<br />
Die Proben wurden <strong>im</strong> Dunkeln bei 4 °C bis zur Messung gelagert.<br />
Messung<br />
Der Druck zur Probeninjektion wurde so eingestellt, dass jeweils ca. 200 bis 500 Zellen<br />
pro Sekunde vermessen wurden. Insgesamt wurden 10000 Zellen einer Probe analysiert.<br />
Die Auswertung erfolgte mit der Software FACScount.<br />
Alle Messungen wurden am Institut für medizinische Immunologie, Universitätsklinik,<br />
Halle mit der freundlichen Unterstützung <strong>von</strong> Dr. Mathias Löhn und Dr. Alexander<br />
Santos durchgeführt.<br />
Geräte<br />
Durchfluss-Zytometer: FACSvantage, FACScalibur (Becton-Dickinson), FACS-<br />
Röhrchen (Falcon)<br />
Puffer und Lösungen<br />
Zellkulturmedium, PBS (Gibco), Paraformaldehyd-Lösung (4 % Paraformaldehyd in<br />
PBS)<br />
2.3.8 Fluoreszenzfärbung der Zellkerne, Endosomen und Lysosomen<br />
Zur Visualisierung mittels fluoreszenzmikroskopischer Techniken können subzelluläre<br />
Strukturen mit geeigneten Farbstoffen selektiv angefärbt werden. Das kann entweder<br />
durch markierte Antikörper erfolgen, die an best<strong>im</strong>mte Proteine binden, oder direkt<br />
durch eine spezifische Bindung der Farbstoffe. Bei Verwendung best<strong>im</strong>mter Farbstoffe<br />
oder markierter Antikörper müssen die Zellen fixiert und permeabilisiert werden, damit<br />
eine Bindung innerhalb der Zellen erfolgen kann. Andere Farbstoffe werden dagegen<br />
<strong>von</strong> lebenden Zellen aufgenommen und werden einfach dem Zellkulturmedium<br />
zugesetzt.<br />
Für eine Markierung subzellulärer Strukturen wurden am Vortag 40000 bis 60000<br />
Zellen pro cm 2 in ein 8-Well-Kammerdeckglas ausgesät. In den einzelnen Kammern<br />
erfolgte dann die Inkubation mit dem jeweiligen Farbstoff (Tabelle 11).
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