Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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M r Θ ⋅100
⋅
N A
[
Θ]
=
c ⋅ d
Θ: Elliptizität [mdeg], Messgröße
Mr: Molekularmasse [Da]
NA: Anzahl der Aminosäuren
c: Probenkonzentration [mg/ml]
d: Küvettendicke [cm]
Die Dekonvolution der Spektren erfolgte mit dem Programm CDNN, das mit Hilfe
eines neuronalen Netzwerks und eines Basisspektrensatzes die Sekundärstrukturgehalte
berechnet (Böhm et al., 1992).
Die Messung von thermischen Übergängen erfolgte in verschließbaren Küvetten mit
einer Schichtdicke von 1 mm. Die Probe wurde in 1 °C-Schritten von 20 auf 90 °C
aufgeheizt, wobei zwischen jeder Messung eine Pause von 1 min zur vollständigen
Temperierung der Probe lag. Bei jeder Temperatur wurde das CD-Signal bei 220 und
210 nm gemessen.
Geräte
CD-Spektrometer: 62A DS (Aviv), Quarzküvetten (Hellma)
Puffer und Lösungen
CD-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 % (w/v) Glycerol, pH 7.2 (NaOH))
2.2.12 Assemblierung virusanaloger Partikel
Δε =
[Θ]
3300
Die in vitro-Assemblierung polyomavirusanaloger Partikel erfolgte durch eine Dialyse,
wobei der Puffer von Nichtassemblierungs- zu Assemblierungsbedingungen verändert
wurde (Salunke et al., 1986, Salunke et al., 1989).
Nach der Chitinaffinitäts-Chromatographie wurde das VP1-Protein durch Zugabe von
40 % (w/v) Ammoniums ulfat quantitativ gefällt. Bei den Varianten VP1-wt/-2C/-3C
wurden außerdem 50 mM DTT zugegeben. Die Fällung erfolgte unter leichtem
Schütteln bei 4 °C für mindestens 1 h. Das ausgefällte Protein wurde danach für 20 min
bei 20000 ×g abzentrifugiert und in Pentamer-Puffer 1 (cysteinfreies VP1) bzw. in
Pentamer-Puffer 2 (VP1-wt/-2C/-3C) gelöst, so dass die Proteinkonzentration etwa
0.5 mg/ml betrug. Die Probe wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen ein
mindestens 100-faches Volumen Kapsidpuffer dialysiert. Die Dialyse erfolgte bei
Raumtemperatur und dauerte mindestens drei Tage, wobei der Kapsidpuffer ein- bis
zweimal pro Tag gewechselt wurde. Die auf diese Weise assemblierten Kapside
konnten dann analysiert werden oder durch Gelfiltrations-Chromatographie weiter
gereinigt werden.