Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

abgetrennt; die extrahierte DNA befand sich im Überstand und konnte z.B. mit Hilfe
einer Ethanolfällung weiter aufkonzentriert werden.
Reinigung und Aufkonzentrierung mit QIAquick-Kits (Qiagen)
Zum Entfernen von Puffersubstanzen oder Enzymen aus DNA-Lösungen und zum
Aufkonzentrieren (bis auf 30 µl) wurden QIAquick-Kits verwendet. Dabei wurde die
DNA in Puffern hoher Ionenstärke an eine Silikatmatrix gebunden und nach einem oder
mehreren Waschschritten mit einem Puffer niedriger Ionenstärke eluiert.
Es wurde das Nucleotide Removal Kit (Fragmente < 100 bp) und das PCR Purification
Kit (Fragmente > 100 bp) eingesetzt, wobei nach der Vorschrift des Herstellers
verfahren wurde.
Fällung mit Ethanol/Glycogen
Eine Aufkonzentrierung von DNA auf Volumina < 30 µl wurde durch eine
Ethanolfällung erreicht, wobei die DNA gleichzeitig sterilisiert wurde. Der Zusatz von
Glycogen vervollständigt die Fällung und erhöht vor allem bei kleineren Fragmenten
die Ausbeuten. Das Glycogen verbleibt dabei teilweise in der DNA-Lösung, stört
jedoch bei nachfolgenden Schritten nicht.
Für die Ethanol/Glycogen-Fällung wurde die DNA-Lösung auf ein Volumen von 200 µl
gebracht, ein Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
DNA-Lösung
Glycogen
Ammoniumacetat-Lösung
Ethanol (absolut)
200 µl
3 µl
100 µl
700 µl
Der Ansatz wurde gründlich gemischt und für 1 h bei –80 °C inkubiert. Das
DNA/Glycogen-Präzipitat wurde bei 13000 ×g für 30 min abzentrifugiert, mit 100 µl
70%igem Ethanol gewaschen und erneut bei 13000 ×g für 15 min abzentrifugiert.
Abschließend wurde das Pellet in dem gewünschten Volumen Wasser oder Puffer
resolubilisiert.
Geräte
Vakuum-Saugeinrichtung (Promega), Kühlzentrifuge: Fresco (Heraeus)
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit, QIAquick Nucleotide Removal Kit, QIAquick PCR
Purification Kit (alle Qiagen)
Puffer und Lösungen
Ammoniumacetat-Lösung (10 M Ammoniumacetat), EB-Puffer (10 mM Tris),
Glycogen (Roche)
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