Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Vorgang Temperatur Dauer Zyklen
Initiale Denaturierung 95 °C 45 s 1
Denaturierung
Annealing
Extension
95 °C
50-60 °C
72 °C
45 s
45 s
60-600 s *
25-30
Finale Extension 72 °C 600 s 1
* Extensionszeit nach Größe des zu amplifizierenden Fragments: 2 kb/min (Pfu), 1 kb/min (Taq)
Geräte
Thermocycler: Mastercycler gradient (Eppendorf)
Enzyme
Pfu-DNA-Polymerase (Promega), Taq-DNA-Polymerase (Promega)
Puffer und Lösungen
10× Pfu-DNA-Polymerase-Puffer (Promega), 10× Taq-DNA-Polymerase-Puffer
(Promega), dNTP-Mix (25 mM dATP, 25 mM dCTP, 25 mM dGTP, 25 mM dTTP)
2.1.11 Blunt End-Klonierung von PCR-Produkten
Eine Subklonierung von Blunt End PCR-Produkten erfolgte in den Vektor pCR-
BluntIITopo, der bereits linearisiert und mit einer Topoisomerase aktiviert vorlag, so
dass keine DNA-Ligase benötigt wurde. Die Stelle der Insertion befand sich im
Leseraster für einen letalen DNA-Gyrase-Inhibitor (ccdB), so dass nur solche Zellen
überleben konnten, die das Fragment erfolgreich in den Vektor integriert hatten,
wodurch eine hocheffiziente Selektion positiver Klone erreicht wurde.
Die Ligationsreaktion und anschließende Transformation erfolgte nach der Vorschrift
des Herstellers.
Kits
Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit (Invitrogen)
2.1.12 Ortsgerichtete Mutagenese
Zum Einbringen von Punktmutationen oder Insertionen in eine DNA-Sequenz wurden
zwei zueinander komplementäre Oligonukleotide verwendet, die die veränderte
Sequenz enthielten. In einer PCR-ähnlichen Reaktion wurde die Templat-DNA kopiert,
so dass Plasmide mit der neuen Sequenz synthetisiert wurden. Die Templat-DNA wurde
dann in einem zweiten Schritt spezifisch mit dem Enzym Dpn I verdaut, das an einer
methylierten 4 bp-Sequenz schneidet (Abbildung 7). Ein Teil des Ansatzes wurde zur