Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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In allen Zellen konnte deutlich das fluoreszenzmarkierte Peptid nachgewiesen werden.
Der größte Teil des Peptids wurde jedoch nicht ins Zytoplasma freigesetzt, sondern
befand sich in endozytotischen Vesikeln. Jedoch befand sich zu diesem Zeitpunkt nur
ein geringer Anteil des Peptids in zellulären Lysosomen, wie eine Anfärbung der Zellen
mit dem lysosomenspezifischen Farbstoff LysoSensor zeigte (Abbildung 74).
Bei einer gleichzeitigen Markierung des Kapsids mit einem anderen Farbstoff konnte
untersucht werden, inwieweit Kapside und Peptide innerhalb der Zelle assoziiert
verbleiben. Dazu wurden NIH 3T3-Zellen auf analoge Weise mit doppelt markierten
und über Gelfiltrations-Chromatographie isolierten Kapsiden inkubiert. Die subzelluläre
Lokalisation der Peptide und Kapside wurde wiederum am konfokalen Laser-Scanning-
Mikroskop beobachtet. Auch hier zeigte sich ein effizienter Transport des
eingeschlossenen Peptids in die Zellen (Abbildung 75). Die Peptide dissoziierten
teilweise von dem Kapsid. Im Bereich der Zellmembran waren Kapside und Peptide
perfekt colokalisiert, wohingegen in weiter innen liegenden Vesikeln einzelne Vesikel
mit Kapsiden oder Peptiden beobachtet wurden. Die Peptide lagen aber ebenso wie die
Kapside zum größten Teil in endosomalen Vesikeln vor. Eine Lokalisation in
Lysosomen trat teilweise sowohl für Kapside als auch für Peptide auf (Abbildung 75).
Exkurs 2: Die WW-Domäne zur Proteinreinigung
WW-Domänen binden mit relativ hoher Affinität reversibel an prolinreiche Liganden.
Diese Wechselwirkung sollte grundsätzlich für eine Affinitäts-Reinigung rekombinanter
Proteine an einem immobilisierten Ligand geeignet sein.
Zur Affinitäts-Chromatographie wurde das PPLP-Peptid an eine Sulfolink-Matrix
(Pierce) gekoppelt. Die Kopplungseffizienz wurde photometrisch bestimmt und betrug
ca. 60 %. Als Modellprotein wurde ein Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase
(GST) und der WWa-Domäne des forminbindenden Proteins 11 der Maus verwendet
(Bedford et al., 1997). Dieses Fusionsprotein wurde in rekombinanten E. coli in großen
Mengen exprimiert und konnte mit GST-Affinitäts-Chromatographie gereinigt werden.
Mit Hilfe von Oberflächenplasmonresonanz-Messungen wurde eine Bindungskonstante
KD=20 nM bestimmt, die mit den Literaturdaten gut übereinstimmte (Bedford et al.,
1997) und mit VP1-WW150 vergleichbar war.