Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

128
Absorption[mAU]
a
b
1.4 280 nm
1.2
260 nm
583 nm
1.0 492 nm
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Volumen [ml]
100 nm
Abbildung 73. Einschluss von Texas Red-markiertem PPLP-Peptid in Fluorescein-markierte
VP1-WW14-Kapside. (a) Die Integration der Peakflächen im Gelfiltrations-Chromatogramm
ergab einen Einschluss von 230 Peptiden pro Kapsid und die Kopplung von 140 Fluorescein-
Molekülen. Das Elutionsvolumen der Kapside (6-8 ml) ist mrkiert. (b) In einer
elektronenmikroskopischen Aufnahme zeigte sich, dass die peptidhaltigen Kapside dieselbe
Morphologie wie die Wildtyp-Kapside besaßen.
Als ein Modellprotein wurde das grünfluoreszierende Protein (GFP) verwendet. Das
GFP-Gen wurde dazu in den Vektor pTIP kloniert und mit einem C-terminalen Prolin-
Tag exprimiert. Das resultierende Protein GFP-PPLP wurde über Chitinaffinitäts-
Chromatographie gereinigt und für Einschlussexperimente eingesetzt. Dabei konnten
reproduzierbar 10 bis 15 GFP-Moleküle in ein Kapsid eingeschlossen werden, jedoch
wurden in einzelnen Ansätzen auch Einschlussraten von bis zu 260 Molekülen pro
Kapsid erreicht (Günther, 2000). Die Ursache für den relativ geringen Einschluss von
GFP wurde noch nicht geklärt, möglicherweise war die WW-Domäne am VP1-N-
Terminus weniger stabil als bei den Insertionen auf der Außenseite, so dass die Anzahl
der Bindungsstellen mit zunehmender Lagerungsdauer abnahm (Günther, 2000).