Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im
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<strong>VP1</strong>-wt<br />
<strong>VP1</strong>-CallS<br />
<strong>VP1</strong>-2C<br />
C11 C15C19 C114 C273 C282<br />
C19 C114<br />
C11 C15C19 C114 C273 C282<br />
<strong>VP1</strong>-ΔC61 Abbildung 25. Schematische Darstellung <strong>von</strong> <strong>VP1</strong>-<strong>Varianten</strong> zur Untersuchung <strong>des</strong><br />
Assemblierungsmechanismus. Durch ortsgerichtete Mutagenese wurden Cysteine <strong>des</strong> Wildtyp-<br />
Proteins durch Serine ersetzt.<br />
Für die Herstellung der Mutante <strong>VP1</strong>-CallS wurden in dem <strong>VP1</strong>-Gen <strong>im</strong><br />
Expressionsvektor pET21-<strong>VP1</strong>Int alle Cysteine <strong>des</strong> Wildtyp-Proteins durch Serine<br />
ersetzt. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde in drei aufeinanderfolgenden Schritten mit<br />
den Oligonukleotiden C123Sf/C123Sr, C56Sf/C56Sr und C4Sf/C4Sr durchgeführt.<br />
Dabei wurden <strong>im</strong> ersten Schritt Cysteine 11,15 und 19, <strong>im</strong> zweiten Schritt Cysteine 273<br />
und 282 und <strong>im</strong> dritten Schritt Cystein 114 ersetzt. Ausgehend <strong>von</strong> dem<br />
Zwischenprodukt nach dem zweiten Schritt wurde für die Variante <strong>VP1</strong>-2C mit den<br />
Oligonukleotiden S19Cf/S19Cr in einem weiteren Mutageneseschritt Cystein 19 wieder<br />
eingeführt.<br />
Für <strong>VP1</strong>-ΔC61 wurde das <strong>VP1</strong>-Gen aus dem Vektor pET21-<strong>VP1</strong>int über eine PCR mit<br />
den Oligonukleotiden <strong>VP1</strong>-Nde I-5‘ und <strong>VP1</strong>-ΔC61-3‘ amplifiziert. Bei dieser Reaktion<br />
wurden gleichzeitig Restriktionsschnittstellen für Nde I und Xma I eingeführt, mit denen<br />
das verkürzte Gen in den Expressionsvektor zurückkloniert wurde.<br />
Die Sequenzveränderungen aller <strong>Varianten</strong> wurden mit DNA-Sequenzierung mehrerer<br />
Klone überprüft. Durch eine Restriktionsanalyse wurde zusätzlich jeweils die korrekte<br />
Sequenz <strong>des</strong> Plasmids überprüft.
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