Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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2.1.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
DNA-Fragmente mit einer Länge bis 100 bp wurden in vertikalen 12-18%igen
Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Für ein 12%iges Gel wurde folgende Mischung
angesetzt:
PAA 40
5× TBE Puffer
Wasser
TEMED
APS-Lösung
3 ml
2 ml
4.9 ml
10 µl
100 µl
Die Gele wurden zwischen zwei Glasplatten gegossen und hatten eine Dicke von
0.75 mm (analytische Gele) bzw. von 1.5 mm (präparative Gele). Die Elektrophorese
lief über 80-140 min bei 130 V. Zur Detektion der Banden wurden die Gele für 10 min
in SYBR-Gold-Färbelösung geschüttelt.
Geräte
Vertikal-Gelelektrophoresekammer: Mighty Small SE260 (Hoefer), Spannungsquelle:
EPS 600 (Pharmacia)
Puffer und Lösungen
PAA 40 (40 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid, Roth), 5× TBE Puffer (0.45 M Tris,
0.45 M Borsäure, 10 mM EDTA, pH 8.0 (stellt sich ein)), APS-Lösung (10 % (w/v)
APS), Probenpuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 % (w/v) Glycerol, 0.05 % (w/v)
Bromphenolblau, pH 7.2 (HCl)), SYBR-Gold Färbelösung (0.1 µl/ml SYBR-Gold)
2.1.6 Reinigung und Aufkonzentrierung von DNA
Präparative Gelelektrophorese
Aus einem Gemisch von DNA unterschiedlicher Länge, das z.B. durch einen Verdau
mit Restriktionsendonukleasen erzeugt wurde, wurden einzelne Fragmente durch
präparative Elektrophorese gereinigt. Für größere Fragmente wurden dazu Agarosegele
verwendet, kleinere (< 100 bp) konnten besser mit Polyacrylamidgelen aufgetrennt
werden. Nach der Elektrophorese wurden die entsprechenden Banden mit einem
Skalpell ausgeschnitten und aus dem Gel extrahiert.
Bei Agarosegelen wurde dafür das QIAquick Gel Extraction Kit verwendet, wobei
nach der Vorschrift des Herstellers verfahren wurde. Für die Extraktion von DNA, die
aus Polyacrylamidgelen ausgeschnitten worden war, wurde das Gelstück zunächst fein
zerkleinert durch Zentrifugation (13000 ×g, 5 min) in ein 2 ml-Eppendorfgefäß durch
ein ca. 1 mm großes Loch in einem 500 µl-Eppendorfgefäß. Danach wurden 300-700 µl
EB-Puffer zugegeben, und die Mischung wurde für 2-10 h bei Raumtemperatur
geschüttelt. Mit Zentrifugation bei 13000 ×g für 15 min wurden die Polyacrylamidreste