Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Nach Waschen der Säule mit einem Puffer hoher Ionenstärke wurde die Spaltung durch
50 mM DTT induziert. Bei der Elution wurde rekombinantes VP1 isoliert, das im
Western-Blot nachgewiesen werden konnte (Abbildung 16). Die erhaltenen Mengen an
gereinigtem VP1 lagen bei ca. 0.5 mg pro Liter Kultur für die Stämme XL-
1 blue/pCYB-VP1 und DH5α/pCYB-VP1 und bei ca. 3 mg pro Liter Kulturmedium mit
dem Stamm BL21(DE3)/pET21-VP1int.
a
b
Absorption[mAU]
1000
800
600
400
200
0
100 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
20 kDa
10 kDa
Fraktion 1 2 3 4 5 6 7 8 9
280 nm
260 nm
0 5 10 15
Volumen [ml]
20 25 30
M 1 2 3 4 5
VP1Intein-CBD
Abbildung 17. Optimierte Reinigung von VP1. (a) Elution der Chitinaffinitäts-Chromatographie
nach dem induzierten Proteinspleißen. (b) Zusammenfassende SDS-PAGE der Expression und
Reinigung: Gesamtzellen vor (1) und 16 nach Induktion und Wachstum bei 15 °C (2),
unlösliche Zellfraktion (3), Rohextrakt (4), eluiertes VP1, Fraktion 3 (5).
In der nativ eluierten VP1-Fraktion war kein Intein-CBD mehr vorhanden, so dass
durch die Affinitäts-Chromatographie eine effektive Abtrennung erzielt wurde. Es
zeigte sich jedoch auch, dass die Spaltung des Fusionsproteins nur unvollständig
stattgefunden hatte, da nach einer denaturierenden Elution zur Regeneration der Säule
neben dem Intein-CBD auch noch größere Mengen VP1 eluiert wurden (Abbildung 16).
VP1
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