Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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dem Protein verborgen, so dass eine Aggregation durch hydrophobe Wechselwirkungen
der Farbstoffmoleküle vollständig ausgeschlossen werden konnte.
Der Austausch von Threonin 248 gegen Cystein wurde sowohl auf Basis der Variante
VP1-2C, die die beiden disulfidbrückenbildenden Cysteine 19 und 114 enthielt, als auch
auf Basis des cysteinfreien Proteins VP1-CallS hergestellt, so dass eine maximale
Spezifität der Markierungsreaktion gewährleistet war. Das cysteinfreie Protein bot den
Vorteil, dass nicht nur assemblierte Kapside, sondern auch freie Kapsomere markiert
werden konnten. Außerdem sollte durch einen Vergleich von VP1-CallS und VP1-
CallS-T248C die Spezifität der Maleinimidkopplung nachgewiesen werden.
Die ortsgerichtete Mutagenese wurde mit den Oligonukleotiden VP1-T248Cf und VP1-
T248Cr durchgeführt. Als Templat dienten die Plasmide pET21-VP1-2C-Int und
pET21-VP1-CallS-Int. Die Mutagenesereaktionen wurden durch DNA-Sequenzierung
verifiziert.
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
M 1 2
Abbildung 36. SDS-PAGE der gereinigten Proteine VP1-CallS-T248C (1) und VP1-3C (2).
Die beiden neuen Proteine VP1-CallS-T248C und VP1-3C wurden ebenfalls als Intein-
CBD-Fusionsproteine exprimiert und gereinigt (Abbildung 36). Die Ausbeuten waren
hier vergleichbar mit vorherigen Varianten und lagen bei 5 bis 6 mg gereinigtes Protein
pro Liter Schüttelkultur.
3.3.2 Spezifität der Maleinimidkopplung
Maleinimide reagieren bei neutralem pH-Wert spezifisch mit freien Thiolgruppen. Bei
dem Reaktionsmechanismus handelt es sich um eine nukleophile Addition, bei der der
Schwefel der Thiolgruppe die Doppelbindung des Maleinimids nukleophil angreift, so
dass eine stabile Thioetherbindung gebildet wird. Aminogruppen sind unter diesen
Bedingungen nicht reaktiv, da sie protoniert vorliegen und dadurch ihre Nukleophilie
nicht ausreichend für eine Additionsreaktion ist (Brinkley, 1992).
VP1