Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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entsprechenden Fragmente wurden ligiert und als Templat für eine PCR mit den
Oligonukleotiden VP1-NdeI-5‘ und VP1-SmaI-3‘ eingesetzt. Dabei wurde die
zusammengesetzte Sequenz von VP1-WW150 bzw. VP1-WW292 amplifiziert. Die
PCR-Produkte wurden in den Vektor pCR-bluntII-Topo subkloniert, sequenziert und in
den Expressionsvektor pET21-Int umkloniert. In der Sequenz von VP1-WW150 wurden
in zwei Mutageneseschritten außerdem wieder die Cysteine 19 und 114 eingeführt, um
eine vollständige in vitro-Assemblierung des Proteins zu ermöglichen.
Die Sequenzen der resultierenden Expressionsvektoren pET21-VP1-WW150-Int,
pET21-VP1-3C-WW150-Int und pET21-VP1-WW292-Int wurden nochmals durch
DNA-Sequenzierung verifiziert. Anschließend wurden die neuen Proteine in E. coli
exprimiert und über eine Chitinaffinitäts-Chromatographie gereinigt. Alle Proteine
wurden löslich im Zytoplasma exprimiert mit Ausbeuten von etwa 6 mg pro Liter
Schüttelkultur (Abbildung 65).
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
M 1 2 3
Verunreinigung
Abbildung 65. SDS-PAGE der, über Chitinaffinitäts-Chromatographie gereinigten, VP1-
Varianten: (1) VP1-CallS, (2) VP1-WW150, (3) VP1-WW292. Die höhere Masse der VP1-
WW-Fusionsproteine wurde deutlich sichtbar.
3.7.2 Proteincharakterisierung von VP1-WW150 und VP1-WW292
Die Insertion von insgesamt 38 Aminosäuren in die VP1-Sequenz stellt eine
wesentliche Veränderung in dem Protein dar. Die korrekte Faltung der Proteine VP1-
WW150 und VP1-WW292 wurde daher mittels CD-Spektroskopie untersucht. Die
WW-Domäne besteht aus einem antiparallelen β-Faltblatt und sollte somit den β-
Faltblattanteil des gesamte Fusionsproteins gegenüber der VP1-wt-Sequenz erhöhen
(Macias et al., 1996). Die Spektren sind in Abbildung 66 dargestellt. Die Dekonvolution
mit dem Programm CDNN ergab einen deutlich höheren Anteil an antiparallelen β-
Faltblattstrukturen in VP1-WW150-Kapsomeren im Vergleich zu VP1-CallS-
Kapsomeren. Bei VP1-WW292 lag der β-Faltblattanteil geringfügig über dem von VP1-
CallS (Abbildung 66).
VP1
trunkiertes VP1