Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Da DTT in alkalischer Lösung rasch oxidiert wird, wurde der Einsatz von
Hydroxylamin als Nukleophil zur Induktion der Inteinspaltung untersucht. Mit einer
Mischung aus 30 mM Hydroxylamin und 30 mM DTT konnte die Spaltungsreaktion
vervollständigt werden, so dass mit dem Stamm BL21(DE3)/pET21-VP1Int ca. 5 mg
gereinigtes VP1 erhalten wurden. Eine komplette Reinigung nach dem optimierten
Protokoll ist in Abbildung 17 zusammengefasst.
Nach der Affinitätsreinigung wurde in der Proteinlösung noch eine sehr hohe
Absorption bei 260 nm gemessen (Abbildung 17). Bei dieser Verunreinigung handelte
es sich nicht um an VP1 gebundene DNA, da eine Inkubation mit Benzonase und eine
anschließende Dialyse nur zu einer geringfügigen Reduktion der Absorption bei 260 nm
führte. Mit Hilfe einer Ammoniumsulfatfällung des Proteins nach der Affinitäts-
Chromatographie konnte diese Verunreinigung jedoch vollständig abgetrennt werden,
so dass ein proteintypisches UV/Vis-Spektrum des gereinigten VP1 erhalten wurde
(Abbildung 18). Bei dieser Probe tritt bereits eine Lichtstreunung durch die Bildung
virusanaloger Partikel auf, so dass die Basislinie oberhalb von 300 nm von Null
abweicht und das Absorptionsminimum bei 260 nm etwas verschoben ist.
Absorption [AU]
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
240 260 280 300 320 340
Wellenlänge [nm]
Abbildung 18. UV-Spektrum von VP1 nach Reinigung über Chitin-Affinitäts-Chromatographie,
Ammoniumsulfatfällung und Dialyse gegen Assemblierungspuffer.