Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Signal[RU]
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-50 0 50 100 150 200 250 300
Zeit [s]
Abbildung 76. Biacore-Messungen mit GST-WW und immobilisiertem PPLP-Peptid unter
verschiedenen Pufferbedingungen (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2): ohne Zusatz (rot),
+1 M Ammoniumsulfat (blau), +500 mM L-Arginin (grün).
Zunächst wurden Bedingungen gesucht, unter denen die Wechselwirkung der WW-
Domäne an das prolinreiche Peptid stabilisiert oder destabilisiert wurde. Dazu wurden
Proben des Proteins gegen Puffer mit verschiedenen Zusätzen dialysiert, und die
Bindung an das PPLP-Peptid wurde anschließend mit Oberflächenplasmonresonanz
gemessen (Abbildung 76). Außerdem wurde eine Bindung bzw. Elution des GST-WW-
Proteins unter verschiedenen Pufferbedingungen an 100 µl der Sulfolink-PPLP-Matrix
getestet. Als Zusätze wurden einerseits Substanzen ausgewählt, die Proteine
stabilisieren oder hydrophobe Wechselwirkungen erhöhen, wie Ammoniumsulfat,
Glycerol oder NaCl. Andererseits wurden destabilisierende, aber wenig denaturierende
Substanzen gesucht, die für eine Elution von der Matrix geeignet waren. Dazu gehörten
chaotrope Salze wie Natriumthiocyanat, Guanidin-Hydrochlorid inb niedrigen
Konzentrationen oder L-Arginin. Von den Stabilisatoren zeigte nur 1 M
Ammoniumsulfat einen positiven Effekt. Die Bindung der WW-Domäne konnte jedoch
mit 300 mM L-Arginin vollstänig aufgehoben werden, ebenso wie mit 1 % SDS, das
zur Denaturierung des Proteins führte. Die Einflüsse der einzelnen Substanzen auf die
Bindungseigenschaften der WW-Domäne sind in Tabelle 20 zusammengefasst.
Tabelle 20. Einfluss verschiedener Substanzen auf die Bindung der WW-Domäne an das PPLP-
Peptid; als Puffer diente jeweils 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2
Messpuffer-Zusatz Effekt auf die Bindung der WW-Domäne
200 bis 1000 mM NaCl
30 % (w/v) Glycerol
1 M (NH 4) 2SO 4
20 mM MES, pH 6.0, 20 mM Tris, pH 9.0
1 M NaSCN
0.2 bis 1.5 M Guanidin-HCl
300 bis 500 mM L-Arginin
1 % (w/v) SDS
kein Effekt
kein Effekt
Stabilisierung der Wechselwirkung
kein Effekt
kein Effekt
ab 0.75 M Abnahme der Bindungsaffinität
keine Bindung
keine Bindung