Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Die Funktionalität des Sensorchips wurde mit dem GST-WW-Fusionsprotein getestet,
das eine gute Bindung an das Peptid zeigte und dessen Bindungsaffinität, der in der
Literatur beschriebenen entsprach (Kapitel 2.2.14).
Mit dem Protein VP1-WW292 konnte unter keiner der verwendeten Bedingungen eine
Bindung an den Liganden beobachtet werden. In diesem Protein scheint die WW-
Domäne nicht ihre korrekte Faltung anzunehmen, so dass keine Bindung des
prolinreichen Liganden erfolgen konnte.
Die Proteine VP1-WW150 und VP1-3C-WW150 besaßen hingegen eine hohe
Bindungsaffinität zu dem immobilisierten Peptid. Die Bindung war weitgehend
unabhängig von den Pufferbedingungen. Zunächst wurde in Pentamer-Puffer
gemessen, dem zur Proteinstabilisierung 5 % (w/v) Glycerol zugesetzt waren, aber auch
ohne diesen Zusatz zeigte sich keine Änderung der Bindungsaffinität (Abbildung 70).
Bei einem Wechsel des Puffersystems auf PBS zeigten die VP1-WW150-Kapsomere
keine veränderten Bindungseigenschaften (Abbildung 70). Die Berechnung der
Bindungsparameter erfolgte durch ein Anpassen eines einfachen Langmuir-
Bindungsmodells an die Messkurven. Das Bindungsmodell beschrieb die Assoziation
sehr gut, zeigte aber teilweise deutliche Abweichungen zu Beginn der
Dissoziationsphase. Die kinetischen Parameter der einzelnen Messungen sind in
Tabelle 19 zusammengefasst, wobei jedoch Ungenauigkeiten durch Abweichungen von
dem Modell berücksichtigt werden mussten. Die Bindungsaffinität zu dem Liganden
war zwar insgesamt relativ hoch, jedoch fand ein sehr schneller Austausch statt, so dass
bereits nach 5 min ca. 50 % des Liganden wieder dissoziiert waren.
Tabelle 19. Kinetische Parameter der Bindung von VP1-WW150 an das immobilisierte PPLP-
Peptid nach Näherung der Messkurven an ein Langmuir-Bindungsmodell
Bedingung k a [1/Ms] k d [1/s] K A [1/M] K D [M]
Pentamer-Puffer
Pentamer-Puffer ohne Glycerol
PBS
DMEM + 10% FCS
3.3×10 5
4.3×10 5
4.4×10 5
3.4×10 5
4.9×10 -3
3.3×10 -3
1.8×10 -3
1.6×10 -3
6.7×10 7
1.3×10 8
2.4×10 8
2.1×10 8
1.5×10 -8
7.7×10 -9
4.2×10 -9
4.8×10 -9
Für einen Test der Bindungsspezifität unter eher physiologischen Bedingungen und in
Gegenwart anderer Proteine wurde die Messung in Dulbecco’s Modified Eagle Medium
mit 10 % FCS durchgeführt (Tabelle 19). Die Bindung wurde durch die Serumproteine
nicht verhindert und es trat keine Konkurrenz zu den Bindungsstellen auf der
Kapsidoberfläche auf. Der Ligandenaustausch war auch hier sehr schnell, so dass die
Halbwertszeit eines Liganden an der WW-Domäne etwa 4 min betrug. Die Spezifität
der Bindung konnte durch eine Kompetition mit dem freien prolinreichen Peptid
nachgewiesen werden. In Gegenwart von 1 µM des Peptids wurde die Bindung von
VP1-WW150 an die Chipoberfläche vollständig inhibiert, Serumproteine konnten keine
unspezifischen Wechselwirkungen mit dem Ligand eingehen.