Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Für einen Test einer Affinitäts-Reinigung wurde das GST-WW-Protein in E. coli
exprimiert. Nach einem Zellaufschluss wurde der Rohextrakt durch Zentrifugation
gewonnen und auf eine 3 ml Sulfolink-PPLP-Chromatographiesäule aufgetragen. Nach
dem Auftrag wurde die Säule mit zehn Säulenvolumina eines Waschpuffers mit 1 M
NaCl gewaschen. Das gebundene GST-WW-Protein wurde schließlich mit 300 mM L-
Arginin eluiert (Abbildung 77). Das eluierte Protein war im SDS-Polyacrylamid sehr
rein. Die beobachtete Doppelbande wurde wahrscheinlich durch einen N-terminalen
proteolytischen Abbau des GST-WW-Proteins verursacht. Die gesammelten Fraktionen
wurden vereinigt und zur Entfernung des Arginins dialysiert. Biacore-Messungen
zeigten, dass dadurch die Bindungsaffinität der WW-Domäne an das PPLP-Peptid
wieder vollständig hergestellt werden konnte, so dass die Bindungsdestabilisierung
durch L-Arginin ein reversibler Effekt war.
Diese vorläufigen Experimente zeigen, dass Fusionsproteine mit WW-Domäne
grundsätzlich zur Protein-Affinitäts-Chromatographie geeignet sind (Schmidt et al.,
1999b). Die Elution mit 300 mM L-Arginin stellt eine sehr schonende Bedingung dar,
die mit den meisten Proteinen kompatibel sein sollte. In zukünftigen Experimenten
müsste Reinigung weiterer Modellproteine untersucht und optimiert werden. Dabei
wäre es interessant, N- und C-terminale Fusionsproteine zu vergleichen. Außerdem
wäre eine Immobilisierung der WW-Domäne denkbar, so dass Proteine, die einen
Polyprolin-Tag besitzen gereinigt werden könnten.
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
20 kDa
M 1 2 3 M 4 5 6 7 8
GST-WW
Abbildung 77. Expression und Reinigung von GST-WW aus rekombinanten E. coli
(TOP10/pGEX-2TK-WWa). Bahn 1: gesamte Zellen vor Induktion, 2: gesamte Zellen 3 h nach
Induktion mit 1 mM IPTG, 3: Rohextrakt, 4: Waschfraktion, 5-8: Fraktionen bei Elution mit
300 mM L-Arginin.