Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

3.7.5 Herstellung des Expressionsvektors pTIP
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Für eine rekombinante Expression von Proteinen in E. coli mit fusionierten
prolinreichen Sequenzen zur Bindung an WW-Domänen wurde ein allgemeiner
Expressionsvektor konstruiert. Dieser Vektor, pTIP (Plasmid mit T7lac-Promotor,
Intein-CBD-Gen und Prolin-Tag-Sequenzen) enthielt eine Klonierungsstelle mit
mehreren Restriktionsschnittstellen, die wahlweise eine Klonierung des Zielgens
erlaubten, so dass der Prolin-Tag entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des
Zielproteins exprimiert wurde. In der Sequenz zwischen den Prolin-Tags und dem
Zielgen befanden sich zwei Arginine, die eine Erkennungssequenz für die endosomale
Protease Furin darstellen, so dass das Zielprotein im Endosom von seinem Prolin-Tag
abgespalten werden konnte (Schafer et al., 1995). Zusätzlich erlaubte das Plasmid eine
Transkription von dem starken T7lac-Promoter und gestattete die Expression des
Zielproteins als C-terminales Intein-CBD-Fusionsprotein, um eine einfache Reinigung
über Chitinaffinitäts-Chromatographie zu ermöglichen (Abbildung 71).
MetProProPro ProProProProPro LeuProGlyLeuGly
CATATGCCGCCACCT CCACCGCCACCTCCG TTACCAGGCCTAGGC
GTATACGGCGGTGGA GGTGGCGGTGGAGGC AATGGTCCGGATCCG
Nde I Avr II
ArgArgGlyLeuAla ThrSerHisGlyLeu SerArgArgAlaSer
CGGCGTGGGCTAGCG ACGTCCCATGGCTTA AGCCGACGTGCCTCA
GCCGCACCCGATCGC TGCAGGGTACCGAAT TCGGCTGCACGGAGT
Nhe I Aat II Nco I Afl II Bsu36 I
GlyProProProPro ProProProProLeu ProGly Intein
GGTCCGCCGCCTCCA CCGCCACCGCCTTTA CCCGGGTGCTTTGCC
CCAGGCGGCGGAGGT GGCGGTGGCGGAAAT GGGCCCACGAAACGG
Sma I
lacI
ori
T7lac
(7159 bp)
Abbildung 71. Der E. coli Expressionsvektor pTIP. Die Multiklonierungsstelle erlaubt Fusionen
des Zielproteins, die wahlweise N- oder C-terminale Prolin-Tags besitzen.
Basis des Plasmids pTIP war das Plasmid pET21-VP1Int. Das VP1-Gen wurde
herausgeschnitten und durch einen synthetischen Linker ersetzt, der aus zwei Paaren
intein
amp
f1 ori
cbd
Eco RI