Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

112
RelativeFluoreszenzintensität
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
ohne Kompetitor
mit VP1-R77W
mit VP1-2C
Vergleich: VP1-CallS-T248C
Abbildung 60. Messung der Aufnahme von VP1-R77W in eukaryontische Zellen mittels
Durchfluss-Zytometrie. VP1-R77W wird unter identischen Bedingungen mit höherer Effizienz
als VP1-CallS-T248C aufgenommen, die Aufnahme kann jedoch sowohl mit unmarkiertem
VP1-2C als auch mit VP1-R77W kompetitiert werden.
3.6.4 Replikation von Polyomavirus-R77W
Die vorangegangenen Experimente hatten gezeigt, dass der Verlust der
Sialyloligosaccharidbindung allein nicht für eine Blockierung der Aufnahme
polyomavirusanaloger Partikel in eukaryontische Zellkulturen ausreicht. Die Aufnahme
muss dabei jedoch nicht notwendigerweise mit der Virusreplikation korrelieren, da
durch die Kohlenhydratbindung Signale in der Zelle ausgelöst werden, die diese auf die
Virusreplikation vorbereiten (Glenn & Eckhart, 1990, Zullo et al., 1987). Kürzlich
wurde berichtet, dass die Mutation von Arginin 77 zu Glutamat oder Glutamin zu einem
vollständigen Replikationsverlust des Virus führte (Bauer et al., 1999). Daher wurde
untersucht, ob die Mutation von Arginin 77 zu einem Tryptophan ebenfalls zu einem
Verlust der Replikationsfähigkeit des Virus führen würde.
Das Plasmid pX3f-pY wurde als Templat für eine Mutagenese mit den
Oligonukleotiden VP1-R77Wf und VP1-R77Wr eingesetzt. Die Mutation wurde durch
DNA-Sequenzierung verifiziert. Aus dem Plasmid wurde das veränderte
Polyomavirusgenom pY-R77W ausgeschnitten und religiert. Mit diesem Plasmid
wurden NIH 3T3-Zellen transfiziert, gleichzeitig wurde zur Kontrolle eine Transfektion
mit dem Wildtyp-Genom pY durchgeführt.
In der Kultur, die mit pY-R77W transfiziert worden war, wurden auch nach acht Tagen
noch keine zytopathischen Effekte beobachtet, wobei in der Kontrollkultur mit dem
Wildtyp-Virus bereits nach vier Tagen ein massives Absterben der Zellen beobachtet
wurde (Abbildung 61). Fünf Tage nach der Transfektion wurden Proben aus dem
Medium entnommen und mit einem Hämagglutinations-Assay auf das Vorhandensein