Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

a
b
c
d
P CMV
P CMV
P CMV
P CMV
globin IVS
2 x TetO2
globin IVS
2 x TetO2
TetR
TetR
SV40pA
GFP
SV40pA
137
Bam HI Xho I
Abbildung 79. Ausschnitte aus den Plasmiden zur Herstellung von Verpackungszelllinien für
murines Polyomavirus: (a) pcDNA6/TR, (b) pcDNA4/TO-GFP, (c) pcDNA6/TR-GFP, (d)
pcDNA4/TO-T-Anti.
Das Plasmid pcDNA6/TR wurde zur Expression des Tetracyclin-Repressors benötigt.
Es besaß ein Blasticidin S-Resistenzgen zur Selektion stabiler Zelllinien (Takeuchi et
al., 1958, Yamaguchi et al., 1965, Kimura et al., 1994, Izumi et al., 1991). Für einen
Test einer Tetracyclin-regulierten Expression in cis wurde ein DNA-Fragment mit den
Oligonukleotiden CMVtet-BstBI-5‘ und BGHpA-BstBI-3‘ aus dem Vektor
pcDNA4/TO-T-Anti amplifiziert, das den Tetracyclin-regulierten CMV-Promotor, das
GFP-Gen und das BGH-Polyadenylierungssignal enthielt. Dieses Fragment wurde über
eine einzelne Bst BI-Restriktionsschnittstelle in den nicht benötigten F1-Origin des
Plasmids pcDNA6/TR einkloniert. Das resultierende Plasmid pcDNA6/TR-GFP konnte
zu einer Tetracyclin-regulierten GFP-Expression verwendet werden, ohne dass eine
weitere Transfektion mit einem regulatorischen Plasmid erforderlich war
(Abbildung 79).
Herstellung der Verpackungszelllinien
f1ori
Bst BI
Bam HI Eco RI
BGH pA
P CMV
2 x TetO2
Bst BI Bam HI Eco RI Bst BI
T-Antigene
Da die Regulierbarkeit der Genexpression bei dem Tetracyclin-System vom Zelltyp
abhängen kann, wurden die Verpackungszelllinien auf Basis der murinen Zelllinien
NIH 3T3 (Fibroblasten) und C2C12 (Myoblasten) hergestellt (Tabelle 21). Die Zellen
wurden zunächst mit dem regulatorischen Plasmid pcDNA6/TR transfiziert, das den
Tetracyclin-Repressor exprimierte. Zum Test einer regulierten Expression wurden
jeweils 24 stabile Klone transient mit dem Plasmid pcDNA4/TO-GFP transfiziert. In
den Zellen wurde die GFP-Expression mit und ohne Tetracyclin betrachtet, zur
Ermittlung der Klone, die den Tetracyclin-Repressor in ausreichender Menge
exprimierten. In allen Zellen konnte unabhängig von der verwendeten Zelllinie auch
ohne Tetracyclin eine schwache bis starke Basalexpression beobachtet werden, die
jedoch bei Zugabe von Tetracyclin deutlich erhöht wurde.
Parallel dazu wurde die Expression des Repressors in cis getestet, indem stabile
Zelllinien mit dem Plasmid pcDNA6/TR-GFP erzeugt wurden. Ebenfalls 24 Klone
GFP
BGH pA
BGH pA