Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Abbildung 8. Prinzip der Biacore Messung, Winkel des reflektierten Lichts ohne Analyt (a) und
mit Analyt-Ligand-Wechselwirkung (b); der Analyt wird in einem Pufferstrom über die
Chipoberfläche geleitet (nach BIAapplication Handbook, 1994).
Herstellung eines Sensorchips
Zur Kopplung des PPLP-Peptids an einen CM5-Sensorchip wurde die Methode der
Aminokopplung durch reaktive Ester verwendet (BIAapplications Handbook, 1994).
Dabei werden die auf der Chipoberfläche vorhandenen Carboxylgruppen mit EDC/NHS
aktiviert, so dass eine Peptidbindung mit der N-terminalen Aminogruppe des Peptids
gebildet werden konnte. Dafür wurde so viel der PPLP-Peptid-Lösung injiziert, bis ca.
200 RU auf den Chip gebunden worden waren (Abbildung 9). Freie reaktive Gruppen
wurden durch Zusatz von Ethanolamin abgesättigt. Die Referenzoberfläche des
Sensorchips wurde ebenfalls aktiviert und komplett mit Ethanolamin abgesättigt. Die
erfolgreiche Kopplung des PPLP-Peptids wurde abschließend durch Injektion des GST-
WW-Fusionsproteins überprüft (Abbildung 9).
Messung
Die Messungen erfolgten bei 20 bis 30 °C und einer Flussrate von 20 µl/min. Die
Proteinlösungen wurden vor der Messung gegen den Messpuffer dialysiert. Die Proben
wurden vor der Injektion 20- bis 100-fach im Messpuffer verdünnt. Das Probenvolumen
betrug 100 µl, wobei 60 µl auf den Chip injiziert wurden. Die Dissoziation wurde über
einen Zeitraum von 5 bis 10 min gemessen. Danach wurde noch gebundener Analyt
durch Injektion von 60 µl SDS-Lösung eluiert. Die Auswertung der Messungen erfolgte
mit der Biaevaluation Software.
Geräte
Sensorchip
mit Goldfilm
Lichtquelle
BIACORE X (Biacore AB), Sensorchip CM5 (Biacore AB)
Puffer und Lösungen
Y
Y
Y
Y
Prisma
Y
Y
Y
PPLP-Peptid-Lösung (5 mg/ml PPLP-Peptid (CSGP8LP), 10 mM Natriumacetat, pH 4.6
(Essigsäure)), EDC/NHS (200 mM EDC, 200 mM NHS), SDS-Lösung (1 % (w/v)
SDS)
Y
Y
Y
Y
Y
a
Detektor
b