Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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wurden auf eine induzierbare GFP-Expression analysiert. Die basale Expression lag
aber in diesem Fall deutlich höher als bei einer Expression in trans, so dass die Menge
des exprimierten Repressors in beiden Zelllinien nicht für eine effektive Inhibierung der
GFP-Expression ausreichte.
Tabelle 21. Selektion und Analyse stabiler Zelllinien.
Zelllinie
NIH 3T3
C2C12
Test der
Genexpression
stabile Transfektion mit
pcDNA6/TR pcDNA6/TR-GFP pcDNA4/TO-T-Anti
>100 Klone
24 analysiert
>100 Klone
24analysiert
Transfektion mit
pcDNA4/TO-GFP,
GFP-Expression
>100 Klone
24 analysiert
>100 Klone
24 analysiert
GFP-Expression
>100 Klone
48 bzw. 10 analysiert
2 Klone
2 analysiert
Transfektion mit
pY-GFP bzw. RT-PCR
Fünf Klone, die den Tetracyclin-Repressor von dem Plasmid pcDNA6/TR exprimierten
und die die beste Induzierbarkeit zeigten, wurden für den zweiten Transfektionsschritt
mit dem Plasmid pcDNA4/TO-T-Anti ausgewählt. Nach der Selektion auf eine stabile
Integration wurden mit den NIH 3T3-Zellen über 100 Klone erhalten, mit C2C12
dagegen nur zwei, obwohl die Transfektionseffizienz bei den vorangegangenen
Experimenten nicht unter der von NIH 3T3-Zellen lag. Es wurden 24 Klone von
NIH 3T3-Zellen und 2 Klone von C2C12-Zellen isoliert und auf eine Expression der T-
Antigene untersucht.
3.8.3 Expression der T-Antigene in stabil transfizierten Zellen
Die Expression der T-Antigene wurde zunächst in 48 Klonen von NIH 3T3-Zellen und
2 Klonen von C2C12-Zellen durch eine transiente Transfektion mit dem Plasmid pY-
GFP bei gleichzeitiger Inkubation mit tetracyclinhaltigem Medium untersucht. Bei einer
korrekten Expression der T-Antigene sollte dieses modifizierte Polyomavirusgenom
repliziert und in neue Viruspartikel verpackt werden. In diesen Zellen sollte das
Reportergen GFP sehr stark exprimiert werden und die GFP-Expression sollte sich
durch eine Infektion benachbarter Zellen mit neu produzierten Viruspartikeln über die
gesamte Kultur ausbreiten.
Erwartungsgemäß wurden in allen Kulturen, die mit pY-GFP transfiziert wurden
zahlreiche GFP-exprimierende Zellen beobachtet. In einigen Klonen konnte auch eine
Ausbreitung der GFP-Fluoreszenz beobachtet werden, die jedoch dadurch limitiert
wurde, dass es in diesen Zellen beschleunigt zu einem Abrunden und zum Zelltod kam.
Die Überstände aus diesen Kulturen wurden auf das Vorhandensein von Viruspartikel
untersucht, die das Plasmid pY-GFP trugen. Dazu wurden die Überstände der Kulturen
abgenommen, für 5 min bei 2000 ×g zum Entfernen von abgestorbenen Zellen