Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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6 3.4.2 Aufnahme in NIH 3T3-Zellen.....................................................................97 Exkurs 1: Analyse von Proteinaggregaten mit Durchfluss-Zytometrie ..........................99 3.5 Insertion eines RGD-Motivs in die VP1-Sequenz ............................................101 3.5.1 Herstellung der Proteine VP1-1RGD150 und VP1-1RGD292 .................101 3.5.2 Integrinrezeptor-Expression in C2C12-Zellen..........................................104 3.5.3 Aufnahme in C2C12-Muskelzellen...........................................................104 3.6 Bindung von VP1 an Sialyloligosaccharide......................................................107 3.6.1 Herstellung und Charakterisierung von VP1-R77W.................................108 3.6.2 Bindung an Sialyloligosaccharide.............................................................110 3.6.3 Aufnahme von VP1-R77W in eukaryontische Zellen...............................110 3.6.4 Replikation von Polyomavirus-R77W ......................................................112 3.7 VP1-Fusionsproteine mit einer WW-Domäne ..................................................114 3.7.1 Herstellung der Proteine VP1-WW150 und VP1-WW292.......................115 3.7.2 Proteincharakterisierung von VP1-WW150 und VP1-WW292................118 3.7.3 In vitro-Assemblierung von VP1-WW150, VP1-3C-WW150 und VP1-WW292.........................................................121 3.7.4 Bindung von VP1-WW150 und VP1-WW292 an prolinreiche Liganden123 3.7.5 Herstellung des Expressionsvektors pTIP .................................................125 3.7.6 VP1 mit N-terminaler Fusion einer WW-Domäne....................................126 3.7.7 Einschluss von Proteinen und Peptiden in virusanaloge Partikel .............127 3.7.8 Delivery von Peptiden in eukaryontische Zellen.......................................129 Exkurs 2: Die WW-Domäne zur Proteinreinigung .......................................................131 3.8 Replikationsdefiziente Polyomaviren................................................................134 3.8.1 Herstellung des Vektors pY-GFP..............................................................134 3.8.2 Verpackungszelllinien für murines Polyomavirus ....................................135 3.8.3 Expression der T-Antigene in stabil transfizierten Zellen.........................138 3.8.4 RNA-Spleißen bei nativem Polyomavirus ................................................140 3.8.5 Experimente zur Verpackung von Polyomavirusplasmiden.....................141 Exkurs 3: Modularer Kapsidaufbau..............................................................................145 4 Diskussion.............................................................................................................148 4.1 Expression in E. coli, Reinigung und Charakterisierung von VP1 ..................148 4.2 Untersuchung des Assemblierungsmechanismus..............................................150 4.3 Fluoreszenzmarkierte polyomavirusanaloge Partikel .......................................154 4.4 Aufnahme Polyomavirus-analoger Partikel in eukaryontische Zellen..............155 4.5 Insertion eines RGD-Motivs in die VP1-Sequenz ............................................158 4.6 Bindung von VP1 an Sialyloligosaccharide......................................................159 4.7 VP1-Fusionsproteine mit einer WW-Domäne ..................................................162 4.7.1 Die WW-Domäne auf der Kapsidaußenseite ............................................162 4.7.2 Die WW-Domäne auf der Kapsidinnenseite .............................................163
4.8 Replikationsdefiziente Polyomaviren................................................................165 5 Zusammenfassung und Ausblick...........................................................................168 6 Literatur .................................................................................................................172 7 Anhang ..................................................................................................................191 7.1 Abkürzungen.....................................................................................................191 7.2 Erklärung englischer Fachbegriffe ....................................................................192 7.3 Übersicht über die hergestellten VP1-Varianten...............................................193 8 Danksagung...........................................................................................................194 Lebenslauf.....................................................................................................................195 Erklärung.......................................................................................................................196 7
Seite 1: Untersuchungen von Varianten des Po
Seite 4 und 5: 4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung .
Seite 8 und 9: 8 1 Einleitung 1.1 Molekulare Thera
Seite 10 und 11: 10 dass der Bedarf an Protein Deliv
Seite 12 und 13: 12 unterschieden. Derzeit stellen v
Seite 14 und 15: 14 Die Kondensation bzw. Komplexier
Seite 16 und 17: 16 immungeschwächten Menschen (Tra
Seite 18 und 19: 18 a c b Abbildung 3. Kristallstruk
Seite 20 und 21: 20 VP1 , VP2, VP3 spätes primäres
Seite 22 und 23: 22 die Assemblierung der Virusparti
Seite 24 und 25: 24 2. In vitro-Assemblierung mit al
Seite 26 und 27: 26 2 Methoden und Materialien 2.1 M
Seite 28 und 29: 28 2.1.5 Polyacrylamid-Gelelektroph
Seite 30 und 31: 30 2.1.7 Dephosphorylierung von DNA
Seite 32 und 33: 32 Vorgang Temperatur Dauer Zyklen
Seite 34 und 35: 34 Puffer und Lösungen 10× Pfu-DN
Seite 36 und 37: 36 Für die Chitin-Affinitäts-Chro
Seite 38 und 39: 38 Nach dem Gießen der Trenngele w
Seite 40 und 41: 40 PAA 30 4× Nativ-Sammelgelpuffer
Seite 42 und 43: 42 2.2.9 Fluoreszenzmarkierung Zur
Seite 44 und 45: 44 M r Θ ⋅100 ⋅ N A [ Θ] = c
Seite 46 und 47: 46 Abbildung 8. Prinzip der Biacore
Seite 48 und 49: 48 Die Zellsuspension wurde dann so
Seite 50 und 51: 50 Geräte Thermocycler: Mastercycl
Seite 52 und 53: 52 Geräte 4-/6-/24-Well-Platten (N
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56 Probenvorbereitung Zur Messung a
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58 Färbung von Endosomen Dextrane
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60 1vpn), und für die in dieser St
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62 VP1-T248Cr VP1-C248Tf VP1-T248Cr
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64 3 Ergebnisse 3.1 Expression in E
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66 detektieren zu können. In den G
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68 Da DTT in alkalischer Lösung ra
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70 a b VP1-Kapsomer 10 negative Ste
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72 a b c Δε Δε 2 1 0 -1 -2 -3 -
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74 3.2 Untersuchung des Assemblieru
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76 VP1-wt VP1-CallS VP1-2C C11 C15C
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78 a b c ΔεΔε 2 1 0 -1 -2 -3 -4
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80 erfolgte mit Standardproteinen.
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82 3.2.6 Dissemblierung und Stabili
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84 Absorption[mAU] 12 10 8 6 4 2 0
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86 a Absorption[mAU] b 1.0 0.8 0.6
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88 dem Protein verborgen, so dass e
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90 a b RelativeFluoreszenzmarkierun
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92 Von den isolierten Kapsiden wurd
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94 Die fluoreszenzmarkierten Kapsid
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96 a b c d e h i 10 µm 10 µm 10
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98 a b 10 µm 10 µm 10 µm d e 10
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100 VP1-CallS-T248C-Kapsomere wurde
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102 RGD-Motiv Abbildung 48. Modell
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104 3.5.2 Integrinrezeptor-Expressi
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106 Die Beobachtungen, die am Fluor
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108 ionische Wechselwirkung aufgeho
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110 Die in vitro-Assemblierung wurd
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112 RelativeFluoreszenzintensität
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114 3.7 VP1-Fusionsproteine mit ein
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116 a b Abbildung 63. Modell der St
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118 entsprechenden Fragmente wurden
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120 Weiterhin wurde die Thermostabi
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122 Gleichgewicht zwischen Kapsomer
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124 Die Funktionalität des Sensorc
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126 komplementärer Oligonukleotide
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128 Absorption[mAU] a b 1.4 280 nm
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130 effizientes Delivery-System fü
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Signal[RU] 132 60 50 40 30 20 10 0
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134 3.8 Replikationsdefiziente Poly
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136 der Viruspartikel in diesen Zel
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138 wurden auf eine induzierbare GF
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140 Polyomavirus T-Antigens in diff
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142 al., 1996). Im Genom des Maus-P
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144 a Verhältnis: DsRed/GFP DsRed-
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Kapsidanteil[%] 146 a 100 100 b 80
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148 4 Diskussion 4.1 Expression in
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150 Proteasen. Allerdings wurde fü
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152 Bedingungen nur bei 55 %, so da
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154 4.3 Fluoreszenzmarkierte polyom
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156 nachgewiesen wurden. Der hier g
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158 4.5 Insertion eines RGD-Motivs
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160 10 -3 bis 10 -4 M bestimmt (Ste
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162 4.7 VP1-Fusionsproteine mit ein
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166 Plasmid GFP unter Kontrolle des
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168 5 Zusammenfassung und Ausblick
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170 Bindung allein nicht ausreicht,
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172 6 Literatur Ahrens, E.R., Gossa
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174 Bowen, J.H., Chlumecky, D., D
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176 Clark, B. & Desselberger, U. My
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178 Fried, H., Cahan, L.D. & Paulso
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180 Huang, S., Endo, R.I. & Nemerow
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184 Park, E., Starzyk, R.M., McGrat
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186 Sahli, R., Freund, R., Dubensky
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188 Taichman, L.B., Breitburd, F.,
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190 Zhou, Z. & Muzycka, N. In vitro
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192 7.2 Erklärung englischer Fachb
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194 8 Danksagung Die vorliegende Ar
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196 Erklärung Hiermit erkläre ich
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