Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

Geräte
Fluoreszenzspektrometer: F-4500 (Hitachi), Fluoreszenzküvetten (Hellma)
2.2.11 Zirkular-Dichroismus-(CD)-Spektroskopie
Chirale Moleküle Wechselwirken charakteristisch mit zirkular polarisiertem Licht,
abhängig von der Wellenlänge und der Polarisationsrichtung des eingestrahlten Lichts.
Auf diese Weise treten Absorptionsunterschiede zwischen links und rechts zirkular
polarisiertem Licht auf (Holtzhauer, 1996, Galla, 1988). Zirkular polarisiertes Licht
wird aus linear polarisiertem Licht erzeugt, indem linear polarisiertes Licht durch ein
λ/4- Plättchen gelenkt wird. Dies führt zu einer Polarisierung des linear polarisierten
Lichts im Winkel von 90° und einer Phasenverschiebung um λ/4, so dass die Summe
beider Vektoren (linear polarisiertes Licht und orthogonal polarisiertes Licht mit einer
Phasenverschiebung um λ/4) zirkular polarisiertes Licht ergibt. Im CD-Spektrometer
wird die Probenküvette mit zirkular polarisiertem Licht durchstrahlt, das mit einer
Frequenz im kHz-Bereich die Polarisationsrichtung von rechts und links zirkular
polarisiertem Licht ändert, wobei die Absorption der Probe mit einem Photomultiplier
gemessen wird. Die Messung und Berechnung des Absorptionsunterschieds zwischen
links und rechts zirkular polarisiertem Licht erfordert eine äußerst genaue Optik und
Auswerteelektronik, da die gemessene Grundabsorption bereits sehr hoch und der
Absorptionsunterschied sehr klein ist (Schmid, 1989).
Bei der CD-Spektroskopie von Proteinen lassen sich verschiedene
Sekundärstrukturelemente durch charakteristische Spektren unterscheiden (Brahms &
Brahms, 1980). Im Fern-UV-Bereich absorbieren die π-Elektronen der Amidgruppen
des Proteins (Johnson, 1990). In diesem Wellenlängenbereich können Unterschiede im
Proteinrückgrat und somit in den Sekundärstrukturelementen detektiert werden. Aus
den Spektren lassen sich näherungsweise durch Dekonvolutionsprogramme die
Sekundärstrukturgehalte der gemessenen Proben berechnen. Außerdem lassen sich mit
Hilfe der CD-Spektroskopie thermische Proteinstabilitäten bestimmen, wobei während
des Aufheizens der Probe die Abnahme des CD-Signals und somit das Entfalten des
Proteins gemessen wird.
Die Messung von CD-Spektren erfolgte in Plättchenküvetten einer Schichtdicke von
0.1 mm in 1 nm-Schritten in einem Bereich von 260 bis 195 nm, wobei die Messzeit bei
jedem Punkt 16 s betrug. Um möglichst rauscharme Spektren zu erhalten, wurden von
jeder Probe fünf Spektren akkumuliert. Außerdem wurde auf die gleiche Weise der
Puffer, gegen den die Probe zuvor dialysiert worden war, vermessen. Das daraus
resultierende Spektrum wurde von dem Probenspektrum subtrahiert. Das korrigierte
Probenspektrum (mdeg gegen Wellenlänge) wurde dann in ein normalisiertes Spektrum
(Δε gegen Wellenlänge) umgerechnet:
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