Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

10× Puffer
DNA (100-200 ng/µl)
10× BSA (falls erforderlich)
Wasser
Restriktionsendonuklease (1-2 U/µl)
1.0 µl
1.0 µl
1.0 µl
6.0-7.0 µl
1.0 µl
Ein typischer präparativer 30 µl-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
10× Puffer
10× BSA (falls erforderlich)
DNA (100-200 ng/µl)
Restriktionsendonuklease (10 U/µl)
3.0 µl
3.0 µl
23.0-26.0 µl
1.0 µl
Analytische Ansätze wurden, soweit für bestimmte Enzyme vom Hersteller nicht anders
angegeben, für 1-3 h bei 37 °C inkubiert, präparative Ansätze für 5-24 h.
Enzyme
Aat II, Afl II, Avr II, Bam HI, Bgl II, Bst BI, Dpn I, Eco RI, Fok I, Fsp I, Kas I, Nde I,
Nhe I, Nsi I, Sma I, Sph I, Xho I, Xma I (alle New England Biolabs), Eam I104I
(Stratagene)
Puffer und Lösungen
Puffer 1, Puffer 2, Puffer 3, Puffer 4, Eco RI-Puffer, Nsi I-Puffer, Bam HI-Puffer (alle
New England Biolabs)
2.1.4 Agarose-Gelelektrophorese
DNA-Fragmente mit einer Länge von 100-10000 bp wurden elektrophoretisch in 0.7-
2.0 %igen Agarosegelen getrennt. Die Agarose wurde in 1× TAE-Puffer unter
Erwärmen gelöst und nach Zugabe von 5000× Ethidiumbromid-Lösung in eine
horizontale Gelkammer gegossen. Die Elektrophorese wurde spannungslimitiert bei
90 V (7×8 cm-Gele) bzw. bei 110 V (12×14 cm-Gele) durchgeführt und war nach 45-
60 min beendet.
Geräte
Horizontal-Gelelektrophoresekammern: B1A und B2 (Owl Scientific),
Spannungsquelle: EPS 600 (Pharmacia)
Puffer und Lösungen
50× TAE-Puffer (2 M Tris, 1 M Essigsäure, 100 mM EDTA, pH 8.1 (stellt sich ein)),
Probenpuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 % (w/v) Glycerol, 0.05 % (w/v)
Bromphenolblau, pH 7.2 (HCl)), 5000× Ethidiumbromid-Lösung (1 mg/ml
Ethidiumbromid), 1 kb DNA-Marker (New England Biolabs), 100 bp DNA-Marker
(New England Biolabs)
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