Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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der Viruspartikel in diesen Zellen zu ermöglichen. Für eine Anpassung der T-Antigen-
Expression an die zur Replikation benötigten Mengen und zur Vermeidung einer
Zelltransformation durch diese Proteine wurde ein regulierbares Expressionssystem
gewählt.
Die Expression der T-Antigene erfolgte über einen Tetracyclin-regulierten Promotor, so
dass die Transkription bei Zugabe des Antibiotikums Tetracyclin induziert wurde (Yao
et al., 1998). Im Gegensatz zu anderen Tetracyclin-regulierten Expressionssystemen,
die Hybridproteine aus regulatorischen Molekülen und viralen Transaktivatordomänen
verwenden (Gossen & Bujard, 1992), wurden in den hier verwendeten Vektoren nur
Sequenzen des nativen tet-Operons eingesetzt (Yao et al., 1998), so dass die
Tetracyclin-regulierte Expression mehr dem bakteriellen tet-Operon ähnelte (Hillen &
Berens, 1994, Hillen et al., 1983), und potentielle toxische Nebeneffekte von viralen
Transaktivatordomänen vermieden wurden.
Das hier verwendete, regulierbare Expressionsplasmid pcDNA4/TO erlaubte eine
Expression der T-Antigene unter Kontrolle eines CMV-Promotors (Andersson et al.,
1989, Boshart et al., 1985, Nelson et al., 1987), in den 2 Kopien der tet-Operator-2-
Sequenz (TetO2) tandemartig inseriert worden waren. Jede dieser Sequenzen kann zwei
Tet-Repressor-Moleküle binden. Bei Abwesenheit von Tetracyclin bildet der Tet-
Repressor ein Homodimer, das unter physiologischen Bedingungen mit extrem hoher
Affinität an die TetO2-Sequenz bindet (Bindungsassoziations-Konstante
KA = 2×10 11 M -1 , Hillen & Berens, 1994) und die Transkription des Zielgens blockiert.
Tetracyclin bindet mit hoher Affinität an das Tet-Repressor-Homodimer
(Bindungsassoziations-Konstante KA = 3×10 9 M -1 , Hillen & Berens, 1994), was zu einer
Konformationsänderung in dem Repressor führt. Dadurch dissoziiert der Tet-Repressor-
Tetracyclin-Komplex von dem Tet-Operator, so dass die Transkription des Zielgens
induziert wird.
Herstellung der Plasmide für die Verpackungszelllinien
Zur Herstellung der stabilen Verpackungszelllinien wurden die Plasmide pcDNA4/TO-
GFP, pcDNA6/TR-GFP und pcDNA4/TO-T-Anti hergestellt (Abbildung 79). Das
Plasmid pcDNA4/TO besaß einen CMV-Promotor mit Tetracyclin-
Repressorbindungsstellen für eine regulierte Expression des Zielgens. Außerdem
enthielt es ein Zeocin-Resistenzgen zur Selektion stabiler Zelllinien (Baron et al., 1992,
Drocourt et al., 1990, Mulsant et al., 1988, Perez et al., 1989). Das GFP-Gen wurde mit
den Oligonukleotiden GFP-BamHI-5‘ und GFP-EcoRI-3‘ amplifiziert und über
Bam HI- und Eco RI-Schnittstellen in das Plasmid pcDNA4/TO einkloniert. Analog
wurde der Bereich der T-Antigene aus dem Polyomavirusgenom mit den
Oligonukleotiden T-Anti-BamHI-5‘ und T-Anti-XhoI-5‘ amplifiziert und über Bam HIund
Xho I-Schnittstellen in das Plasmid pcDNA4/TO einkloniert. Die resultierenden
Plasmide pcDNA4/TO-GFP und pcDNA4/TO-T-Anti erlaubten eine Tetracyclinregulierte
Expression von GFP bzw. der T-Antigene, bei einer gleichzeitigen
Transfektion mit dem regulatorischen Plasmid pcDNA6/TR.