Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Nach dem Gießen der Trenngele wurde die Lösung mit Isopropanol überschichtet, bis
das Gel polymerisiert war. Danach wurde das Isopropanol entfernt und die 6 %ige
Sammelgellösung angesetzt (ausreichend für zwei Gele) und über das Trenngel
gegossen:
PAA 30
4× Sammelgelpuffer
Wasser
TEMED
APS-Lösung
3 ml
2 ml
4.9 ml
10 µl
100 µl
Die Proben wurden mit mindestens 25 % ihres Volumens mit Probenpuffer versetzt und
für 5 min auf 98 °C erhitzt. Die Elektrophorese lief in Tris/Glycin-Puffer bei 35 mA pro
Gel und war nach 50 bis 60 min beendet. Die Gele wurden dann zunächst 10 min in
PAGE-Fixierer fixiert und dann 30 min mit PAGE-Färber gefärbt. Anschließend
wurden sie in 10 % (v/v) Essigsäure gelagert.
Geräte
Vertikal-Elektrophoresekammer: Mighty small SE200 (Hoefer), Netzteil: EPS-200
(Pharmacia)
Puffer und Lösungen
PAA30 (30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid, Roth), 4× Trenngelpuffer, 4×
Sammelgelpuffer, TEMED (Roth), APS-Lösung (Ammmoniumperoxodisulfat,
gesättigt), 5× Tris/Glycin-Puffer (15 g Tris-Base, 72 g Glycin, 2.5 g SDS, pH stellt sich
ein), Probenpuffer, PAGE-Fixierer (10 % (v/v) Essigsäure, 25 % (v/v) Isopropanol),
PAGE-Färber (10 % Essigsäure, 0.006 % Coomassie Brilliant Blue G250), 10 % (v/v)
Essigsäure
2.2.6 Konzentrationsbestimmung
Proteine absorbieren Licht im UV-Bereich bei 280 nm durch aromatische Aminosäuren
und Disulfidbrücken. Die Absorption ist von der Anzahl der im Protein vorhandenen
Tryptophan- und Tyrosinreste sowie der Anzahl der Disulfidbrücken abhängig. Bei
bekannter Sequenz kann der Absorptionskoeffizient näherungsweise berechnet werden
(Pace et al., 1995):
ε280 nm [M -1 cm -1 ] = 5500 × nTryptophan + 1490 × nTyrosin + 125 × nDisulfidbrücken
Somit kann durch eine Absorptionsmessung bei 280 nm mit Hilfe des Lambert-
Beerschen Gesetz die Proteinkonzentration bestimmt werden: