Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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Polyomavirus T-Antigens in differenzierenden Myoblasten zur Apoptose führt
(Gottifredi et al., 1999). Dieser Effekt führte wahrscheinlich zu der geringen Anzahl
von Klonen, die bei der Transfektion von C2C12-Zellen mit pcDNA4/TO-T-Anti
beobachtet wurde, so dass in allen Zellen, die das große T-Antigen exprimierten
Apoptose ausgelöst wurde und stabile Klone mit einem defekten T-Antigen-Gen
selektiert wurden.
Tabelle 22. Analyse verschiedener Klone und der Zelllinie C127LT zur Herstellung
replikationsdefizienter Polyomaviren.
Zelllinie #Klone
NIH 3T3
8
2
Expression der T-Antigene
groß mittel/klein
stark
stark
nein
schwach
transfizierende Partikel
nein
30-50 pro ml
C2C12 2 nein nein nein
C127LT - stark nein nein
3.8.4 RNA-Spleißen bei nativem Polyomavirus
Bei den Klonen der Verpackungszelllinien, die auch das mittlere und das kleine T-
Antigen exprimierten konnte die Bildung transfizierender Partikel nachgewiesen
werden. Die mRNAs für das kleine und mittlere Antigen wurden jedoch nur sehr
ineffizient gebildet, so dass ein unzureichendes Spleißen zu diesen mRNAs und damit
eine geringe Expression dieser Genprodukte limitierend für die Bildung
replikationsdefizienter Polyomaviren sein könnte und nur äußerst geringe Titer erreicht
wurden. Daher wurde untersucht, inwieweit das natürliche Polyomavirus die einzelnen
Spleißprodukte bildet.
NIH 3T3-Zellen wurden dazu mit dem Polyomavirusgenom, dem Plasmid pY
transfiziert. Nach zwei Tagen, als erste cytopathische Effekte sichtbar wurden, wurde
die Gesamt-RNA aus den Zellen isoliert und für eine RT-PCR-Analyse eingesetzt
(Abbildung 81). Die Amplifikation der cDNAs der T-Antigene erfolgte mit den
Oligonukleotiden RT-T-Anti-5‘ und RT-T-Anti-3‘. Die cDNAs von VP1, VP2 und VP3
wurden mit den Oligonukleotiden RT-VP1-3-5‘ und RT-VP1-3-3‘ amplifiziert. Die
Hybridisierungsstellen der Oligonukleotide waren so gewählt worden, dass zwischen
den einzelnen Spleißprodukten unterschieden werden konnte. Nur die mRNAs des
mittleren und kleinen T-Antigens konnten nicht unterschieden werden, da sich die
Länge ihrer Introns nur um 9 bp unterschied und diese Differenz nicht mittels
Agarosegelelektrophorese aufgelöst werden konnte. Die mRNAs für die
Strukturproteine konnten für alle drei Genprodukte detektiert werden. Erwartungsgemäß
wurde die mRNA für das äußere Hüllprotein VP1 am häufigsten gebildet, da VP1 im
Kapsid in fünfmal mehr Kopien vorliegt als VP2 und VP3 zusammen. Die mRNAs der
T-Antigene wurden dagegen sehr gleichmäßig gebildet, so dass eine densitometrische
Abschätzung ein Verhältnis der mittleren/kleinen T-Antigen-mRNAs zur mRNA des
großen T-Antigens von ca. 1:1.2 ergab.