Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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2 Methoden und Materialien
2.1 Molekularbiologische Methoden
2.1.1 Transformation von Escherichia coli
Die Transformation von E. coli-Zellen mit Plasmiden erfolgte durch Elektroporation.
50 µl einer Suspension elektrokompetenter Zellen wurden auf Eis in einer
Elektroporationsküvette mit bis zu 2 µl Plasmidlösung gemischt und einem
Elektroschock von 4-5 ms unterzogen. Die Einstellungen am Gerät betrugen dabei
25 µF, 200 Ω und 1.8 kV. Die Suspension wurde mit 350 µl SOC-Medium versetzt, für
1 h bei 37 °C geschüttelt und anschließend auf Agarplatten mit dem entsprechenden
Selektionsantibiotikum ausplattiert.
Geräte
Elektroporator: Gene Pulser (Biorad), Thermoblock: Thermomixer Standard
(Eppendorf)
Puffer und Lösungen
SOC-Medium (20 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 10 mM
MgCl2, 20 mM Glucose, LB-Agar (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 15 g/l
Agar-Agar), 1000× Ampicillin (100 mg/ml Ampicillin), 1000× Kanamycin (50 mg/ml
Kanamycin)
2.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
Aus Über-Nacht-Kulturen mit einem Volumen von 5 ml (Mini), 150 ml (Midi) oder
1.5 l (Mega) wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe von Qiagen Plasmid-Kits nach der
Standardvorschrift isoliert, wobei mit dem Mini-Kit bis zu 20 µg, mit dem Midi-Kit bis
zu 100 µg und mit dem Mega-Kit bis zu 2 mg DNA erhalten wurde.
Kits
QIAspin Plasmid Mini Kit (Qiagen), QIAprep Plasmid Midi Kit (Qiagen), QIAprep
Plasmid Mega Kit (Qiagen)
2.1.3 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
Zur Spaltung von Plasmiden und mit PCR erzeugten DNA-Fragmenten wurden Typ II-
Restriktionsendonukleasen verwendet, die an spezifischen, meist 4–8 bp langen
Erkennungssequenzen schneiden.
Die Kombination von Puffern und Enzymen erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Ein typischer analytischer 10 µl-Ansatz setzte sich folgendermaßen zusammen: