Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im

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zentrifugiert und mit frischen NIH 3T3-Kulturen inkubiert. Dabei konnten in zwei
Kulturen einzelne Zellen beobachtet werden, die GFP exprimierten, so dass ein
Gentransfer stattgefunden haben musste. Die erreichten Virustiter waren jedoch äußerst
gering und lagen im Bereich von 30 bis 50 transfizierenden Partikeln pro ml. Auch ein
Ultraschall-Zellaufschluss zur Präparation noch nicht aus den Zellen freigesetzter
Partikel konnte den Virustiter nicht steigern.
Als Alternative zu den T-Antigen-exprimierenden Zellen, die mit NIH 3T3 und C2C12-
Zellen hergestellt worden waren, wurde die murine Brustkrebszelllinie C217LT
getestet. Diese Zellen wurden durch eine Polyomavirusinfektion transformiert und sind
in der Lage, Plasmide, die den Polyomapromotor besitzen, zu replizieren (Angabe der
Zellbank ATCC). Bei einer Transfektion von C217LT-Zellen mit dem Plasmid pY-GFP
wurde zwar eine starke GFP-Fluoreszenz beobachtet, jedoch konnten keine
transfizierenden Partikel im Überstand nachgewiesen werden.
1000 bp
700 bp
500 bp
300 bp
NIH 3T3 C2C12
M 1 2 3 4 5 6 1 2 C
β-Actin
mittleres/kleines
T-Antigen
grosses T-Antigen
Abbildung 80. RT-PCR-Analyse von Zelllinien, die stabil mit pcDNA6/TR und pcDNA4/TO-
T-Anti transfiziert waren. Dargestellt sind sechs NIH 3T3-Klone, zwei C2C12-Klone und zum
Vergleich die Zelllinie C127LT (C). Nur NIH 3T3-Klone 1 und 2 bilden zu einem geringen Teil
mRNAs für das mittlere und kleine T-Antigen.
Die Expression der T-Antigene auf Ebene der mRNAs wurde in 10 NIH 3T3-Klonen, 2
C2C12-Klonen sowie in C127LT-Zellen untersucht. Dazu wurde aus diesen Zellen die
Gesamt-RNA isoliert und für eine semiquantitative RT-PCR mit den Oligonukleotiden
RT-T-Anti-5‘ und RT-T-Anti-3‘ eingesetzt (Abbildung 80). Die Positionen der
Oligonukleotide wurden so gewählt, dass sie die Introns im frühen primären Transkript
überspannten, so dass zwischen den verschiedenen Spleißprodukten unterschieden
werden konnte (Abbildung 81). Bei der PCR wurden lediglich in 2 NIH 3T3-Klonen
sehr schwach die mRNAs des mittleren bzw. kleinen T-Antigens nachgewiesen. Eine
densitometrische Abschätzung ergab ein Verhältnis der mRNAs der mittleren/kleinen
T-Antigene zur mRNA des großen T-Antigens von etwa 1:20. In diesen beiden Klonen
war zuvor eine geringe Bildung transfizierender Partikel gefunden worden (Tabelle 22).
Alle anderen analysierten NIH 3T3-Klone sowie C127LT-Zellen exprimierten nur das
große T-Antigen. In den beiden Klonen der C2C12-Zellen wurde keine PolyomavirusmRNA
nachgewiesen, in diesen Klonen muss bei der Integration des Plasmids
pcDNA4/TO-T-Anti das Gen für die T-Antigene zerstört worden sein. Parallel zu den
hier durchgeführten Experimenten wurde publiziert, dass die Expression des großen