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Nel congelamento lento, invece, il tempo di esposizione ai fumi d’azoto si prolunga per 40minuti circa prima dell’immersione in azoto liquido.Infine utilizzando uno strumento automatizzato il campione viene portato gradualmente a bassetemperature con un intervallo di 1-10°C/min prima dell’immersione in azoto liquido.Prima della crioconservazione, poiché l’azoto liquido può agire come veicolo di trasmissione perbatteri, funghi, virus, sono necessari preventivamente per il paziente l’esecuzione di markersinfettivologici 11 .Le analisi obbligatorie sono:• Virus Epatite B: HBsAg,• Virus Epatite C: Anticorpi anti-HCV,• HCV-RNA qualitativo (in caso di anticorpi positivi),• HIV: Anticorpi anti-HIV,• Citomegalovirus: Anticorpi anti IgG, Anticorpi anti IgM.La crioconservazione è quindi possibile in caso di negatività dei markers sovra citati, mentre nelcaso di positività la crioconservazione è possibile solo in apposite banche del seme in cui venganoeffettuati percorsi dedicati e specifici per ogni singolo virus.7.3 TECNICHE DI RECUPEROPer il congelamento degli spermatozoi esistono diverse tecniche in base alla sede in cui si intendeeffettuare il prelievo (Tabella 1) (Fig.1).Tabella 1Campione di partenzaTecniche crioconservazione- Liquido seminale - Paillettes a chiusura termostabile da 0,300 mlo 0,500 ml- - Cryovials- Liquido seminale con rarissimi - Paillettes a chiusura termostabile da 0,300 mlspermatozoi- Zona pellucida ovocita animale o umana- PESA - Micro-Paillettes poste in cryovials- MESA - Microgocce in capsule di Petri- TESA - Pipetta da ICSI- TESE - Sfere di alghe Volvox Globator- Urine - Microincapsulazione in biglie di alginato- Cryoloop- Microsfere di agarosioLiquido seminaleIn caso di crioconservazione da liquido seminale la tecnica di comune utilizzo prevede la diluizionedel liquido seminale 1:1 con CPA e l’aspirazione in paillettes ad elevata sicurezza e termostabiliquali le CBS che contengono o 0,300 ml o 0,500 ml. Per l’aspirazione devono essere utilizzatiappositi raccordi (imbout) in modo che la paillette non venga in contatto esternamentecon il liquido seminale. Segue poi la chiusura delle paillettes che deve essere eseguita tramiteuna termosaldatrice 5, 12 . In alternativa alle paillettes possono essere utilizzate delle cryovials contappo a vite da 1,5 ml in cui il seme viene stoccato diluito 1:1 con il crioprotettore 13 .143