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11 Jahre später gelang Burgi und Hershey die Auftrennung von 32 P-markierten
Phagen-DNA-Fragmenten mittels Glukose-Dichte-Gradientenzentrifugation 2 . Durch
diese Arbeit wurden die Grundlagen zur Bestimmung von Organismen mittels DNA-
Fragmenten gelegt.
Durch die Einführung der Auftrennung mittels Gelelektrophorese konnte die Dichtegradientenzentrugation
umgangen werden. Die Kombination mit Restriktionsenzymen,
die die DNA an definierten Stellen schneiden, ermöglicht eine genaue
Bestimmung der Art eines Organismus.
Beim Nachweis mittels radioaktiver Markierung muss die Probe durch eine mehrere
Stunden bis Tage dauernde Lagerung des Gels unter einem Röntgenfilm auf diesem
abgebildet werden. Obwohl die Arbeit mit radioaktiven Isotopen durch die einzuhaltenden
Sicherheitsmassnahmen relativ unhandlich ist, ist diese Markierungstechnik
immer noch weit verbreitet 3,4,5 . Die Ursache dafür besteht darin, dass durch
die 32 P-Markierung mit einem sehr geringen technischen Aufwand eine sehr hohe
Empfindlichkeit erreicht wird.
Mitte der 60er Jahre entwickelten LePecq und Paoletti den Fluoreszenznachweis von
Nukleinsäuren mittels interkallierender, das heißt sich in die DNA einlagernden,
Fluoreszenzfarbstoffen 6 . Dieses Verfahren begann sich in den 70er Jahren auf Grund
seiner schnellen Auswertbarkeit im Labor durchzusetzen und hat sich bis heute als
Standardmethode bei der Detektion von Nukleinsäurefragmenten etabliert 7,8 .
Mitte der 70er Jahre wurden die Markierungstechniken durch die Einführung des
Southern-Blots ergänzt. Dabei werden DNA-Fragmente, die zuvor in einem Gel
aufgetrennt wurden, auf Nylon-Membranen transferiert 9 . Anschließend werden durch
die Hybridisierung mit markierten Sonden, dass heißt Nukleinsäuren, die an eine bestimmte
Sequenz binden, diese Fragmente nachweisbar. Die Markierung der Sonde
kann sowohl radioaktiv als auch optisch, dass heißt durch einen kovalent gebundenen
Farbstoff, erfolgen. Durch die zeitgleich eingeführte Darstellung bestimmter Oligonukleotidsequenzen
mittels Merrifield-Synthese war damit erstmals eine teilweise
Bestimmung der DNA-Sequenz möglich.
In den 80er Jahren wurde in den USA von Mullis die Polymerase-Kettenreaktion
oder PCR entwickelt und im Labor etabliert 10,11 . Durch diese Methode wurde die
Vervielfältigung der DNA und dadurch die Nutzung kleinster Mengen genetischen
Materials, dass heißt ein Nachweis ab etwa 100 Molekülen, möglich. Der Einsatz
von bestimmten kurzkettigen Nukleinsäuren, der für den Start der Reaktion
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