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5.2.2 Optimierung Während der Arbeiten zum Einfluss von Konvektion und Temperatur auf das Hybridisierungssignal konnte ursprünglich keine reproduzierbare Signalstabilität erreicht werden. Aus diesem Grund wurden neben der zuerst eingesetzten Immobilisierungsmethode Standard zwei weitere Varianten mit der Monothiol-Sonde getestet. Abb. 5.5: Vergleich der Oberflächenbelegung der einzelnen Immobilisierungsmethoden. Durch die chronocoulometrischen Bestimmungen der Oberflächenbelegung konnte gezeigt werden, dass die Standard-Immobilisierung und die Methode mit der zweifachen Nachbelegung die höchste Sonden-Belegung aufweisen. Durch den Einsatz der Koimmobilisierung konnte der Wert gesenkt werden. Abhängig von der Konzentration des Nachbelegungsmittels schwankt dieser Wert zwischen 7,5 und 3,5 pmol/cm² und liegt somit nahe dem von Steel et al. 45 ermittelten Optimum von 4 pmol/cm² für die Oberflächenkonzentration eines Monothiol-modifizierten Nukleotides von 20 Basen. 56
Abb. 5.6: Einfluss der Immobilisierungsmethode auf die Signalstabilität der Sonde mit Monothiol-Linker. (A) prozentualer Verlust, (B) unnormierte Messwerte. Immobilisierung bei 4 °C über Nacht (rot), Koimmobilisierung mit 225 µM (grün), 400 µM (türkis), 900 µM (blau) Mercaptohexanol, zweifache Nachbelegung mit Mercaptoundecan und Mercaptohexanol (violett). Messung nach 4 min Hybridisierung in 160 nM TOs-Target an RDE bei 1000 U/min und Raumtemperatur in 10 mM TRIS-Puffer pH 7,5 57
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urn:nbn:de:gbv:28-diss2008-0035-6
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11 Jahre später gelang Burgi und H
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Ursprünglich erfolgte die elektroc
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