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Koimmobilisierung :
Um die Immobilisierung zu optimieren wurden Sonde und Mercaptohexanol sowohl
auf der Scheiben- als auch auf der LTCC-Elektrode koimmobilisiert.
Dazu wurden jeweils 33 µl Sondenlösung mit 3,3 µl verdünnter Nachbelegungslösung
versetzt. Die Verdünnungsstufen wurden für die Optimierung dabei so
gewählt, dass die Endkonzentration des Mercaptohexanols bei 225, 400 bzw.
900 µM lag.
Die Immobilisierung erfolgte über Nacht bei 4 °C mit 18,2 µl Immobilisierungslösung
und ohne Nachbelegung. Zusätzlich zu dieser Modifizierung wurde das
Volumen der Lösung für die Immobilisierung später auf 4 µl verkleinert, da sich in
unserer Arbeitsgruppe bestätigte, dass diese Menge ausreichend ist.
Zweifache Nachbelegung :
Ziel dieser, bei der FRIZ Biochem GmbH entwickelten, Immobilisierungsvariante ist
es die Elektrodenoberfläche hydrophober zu gestalten und dadurch die SAM zusätzlich
zu stabilisieren.
Zu diesem Zweck wurden 16,5 µl Sondenlösung, wie bereits bei der Standardmethode
beschrieben, auf der Elektrodenoberfläche aufgetragen und inkubiert. Im
zweiten Schritt wurden die Elektroden mit 0,25 M PB pH 7,0 und absoluten Ethanol
gespült. Anschließend wurden die Elektroden in einer 1 mM ethanolischen Mercaptoundecan-Lösung
8 h nachbelegt. Danach wurde mit Ethanol und destilliertem
Wasser gespült. Anschließend erfolgte noch eine zweite Nachbelegung über 3 h in
einer 1 mM Mercatohexanol-Lösung in Puffer.
4.3.3 Hybridisierung, Messung und Dehybridisierung
Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die Hybridisierung durch Eintauchen der
Elektrode in ein 10 ml Becherglas mit 2-3 ml Elektrolyt mit dem in der angegebenen
Konzentration enthaltenen Target für 4 min.
Die Probenlösung wurde beim Einsatz der Scheibenelektrode mit einem Wasserbad
auf die angegebene Temperatur eingestellt. Im Gegensatz dazu wurde bei den
Messungen mit der Drahtelektrode die Probentemperatur mit einem Eisbad auf 3-
4 °C und bei der Nutzung der LTCC-Elektrode durch einen Kryostaten auf 7 °C
heruntergekühlt. Die Einstellung der Hybridisierungstemperatur erfolgte bei den
Drahtelektroden durch Anlegen eines Heizstromes bzw. bei den LTCC-Elektroden
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