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Ursprünglich erfolgte die elektrochemische Detektion der DNA durch die Reduktion der Guanin- und Adeninreste der Nukleinsäure an der hängenden Quecksilbertropfenelektrode (HMDE) 23,24 . Diese direkte Detektion von Nukleinsäuren an Quecksilberelektroden wird seit dem von Palecek et al. und anderen Arbeitsgruppen angewandt. So setzten Palecek und seine Mitarbeiter in den letzten 5 Jahrzehnten neben der ursprünglich zur Detektion von Nukleinsäuren verwendeten oszillographischen Polarographie 23 , auch die adsorptive Stripping Voltammetrie 25 , die Differenz Puls Polarographie 26 und die zyklische Voltammetrie 27 ein. In den 70er Jahren untersuchten Valenta und Nürnberg das Verhalten von Polynukleotiden an HMDE und tropfenden Quecksilberelektroden (DME) 28 . Allerdings besitzen die dafür eingesetzten Quecksilberelektroden einige Nachteile. So ist das als Elektrodenmaterial verwendete Quecksilber toxisch. Deshalb ist die Suche nach Alternativen zu diesem Material sinnvoll. Aus diesen Gründen setzte Brabec bereits 1979 Graphitelektroden zur voltammetrischen DNA-Detektion ein 29 . Mit diesem Elektrodenmaterial gelang ihm eine bessere Auftrennung der Oxidationspeaks des Guanins und Adenins. 1981 wiesen Hinnen et al. sowohl denaturierte als auch native DNA an HMDE und Goldelektroden mittels zyklischer Voltammetrie und Kapazitätsmessungen nach 30 . Seit den 90er Jahren wurde der Einsatz von Elektroden auf der Basis von Kohlenstoff für die Analysemethode mit unmarkierter DNA von anderen Arbeitsgruppen verstärkt untersucht. So zeigten Brett et al. 1994 an einer Glasskohleelektrode, dass die Oxidation der beiden Purin-Basen irreversibel ist 31 . Cai et al. detektierten 1996 Plasmid-DNA an Kohlepasteelektroden 32 . Dabei wurden Unterschiede zwischen den potentiometrischen Stripping Analysen (PSA) der nativen, linearen und denaturierten DNA erkennbar. So betrug die Nachweisgrenze der linearen DNA 15 ng/ml. 1999 nutzten Wang und Mitarbeiter eine Bleistiftelektrode zur Detektion von RNA und DNA 33 . Die Arbeitsgruppe Rivas setzte 2006 mit Kohlenstoff-Nanotubes/Chitosan modifizierte Glaskohleelektroden bei Versuchen mit Doppelstrang- und Einzelstrang-DNA ein 34 . Dabei konnte bereits durch die Immobilisierung des Chitosans mit Glutaraldehyd eine sehr starke Erhöhung des Signals erreicht werden. Durch die Zugabe der Nanotubes zu dem Chitosan konnte die Empfindlichkeit fast verdoppelt werden. Neben den bisher genannten Elektrodentypen wurden auch andere Feststoffelektroden untersucht. So gelang es 1999 Fan et al. durch den Einsatz einer Silberelek- 4
trode das Oxidationspotential des Adenosinpeaks-Peaks auf etwa 0,15 V vs. SCE zu senken 35 . Bei den Graphitelektroden lag dieses Potential bei fast 1 V. 2006 untersuchten Hason und Vetterl verschiedene Amalgamelektroden 36 . Dabei erwies sich die Wechselstromvoltammetrie mit einer Platinamalgamelektrode als günstigste Methode für diese Anwendung. Die bisher beschriebenen elektrochemischen Techniken beziehen sich allerdings nur auf die Detektion von Nukleinsäuren ohne Berücksichtigung der Sequenz. Für die Detektion von Mutationen mit unmarkierten Nukleinsäuren sind einige Zwischenschritte notwendig. Aus diesem Grund nutzten Wang et al. bereits 2001 und Palecek et al. 2002 magnetische Nanopartikel zur Isolierung der nachzuweisenden Gensequenz 37 . Dabei wird die zu bestimmende Gensequenz vor der Nachweisreaktion an DNA-modifizierte Nanobeads gebunden. Anschließend erfolgt die Aufreinigung der zu bestimmenden DNA durch die magnetische Abtrennung der Partikel von der Probenlösung. Nach einer darauf folgenden Dehybridisierung, d. h. Aufschmelzen der Sonden-Target- Doppelstränge, erfolgt die jetzt spezifische Bestimmung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz an der Kohleelektrode. Dadurch gelang erstmals die selektive DNA-Bestimmung durch direkte Oxidation der Nukleinsäure. Eine andere Methode besteht darin, Reparaturenzyme einzusetzen. Diese Proteine binden an den Fehlpaarungen. In einen weiteren Schritt werden sie abgelöst und separat elektrochemisch bestimmt. So verwendeten Masarik et al. 2007 das MutS- Protein in Kombination mit Nanopartikeln zur Detektion von DNA-Fehlpaarungen 38 . Bei diesen bisher genannten elektrochemischen Nachweisverfahren mit unmarkierten Proben wird, mit Ausnahme der von Masarik angewendeten Methode, die nachzuweisende Nukleinsäure zerstört. Durch die Einführung chemisch modifizierter DNA in den letzten 2 Jahrzehnten ergab sich eine weitere Möglichkeit der Nukleinsäureanalyse. Grundlage dafür ist ein an der Elektrode immobilisierbares, meist thiolmodifiziertes, Oligonukleotid. Die als Sonde bezeichnete Nukleinsäure dient als spezifische Erkennungssequenz für die nachzuweisende DNA-Sequenz, das Target. Die eigentliche Nachweisreaktion erfolgt erst nach der Bildung des Sonden-Target-Doppelstranges. Dafür kann z. B. die Einlagerung von Interkallatoren in den Nukleinsäurestrang genutzt werden. 5
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Die Fehlpaarung wurde dadurch errei
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5.2.2 Optimierung Während der Arbe
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Bei der Bestimmung der Signalstabil
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der Schwefelatome im Linker erfolgt
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werden. Da die zweite Reaktion irre
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er stark verschwommen. Das zeigt, d
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µA 0.30 0.20 0.10 0.00 Grundstrom
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durchgeführt oder das Potential un
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5.3.4 Vergleich der Marker Marker D
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Elektrodenoberfläche sondern die D
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5.4.3 Temperatur während der Hybri
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Die Kalibrierung erfolgte dabei im
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Abb. 5.22: Vergleich der Stromdicht
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Abb. 5.24: Mikroskopische Aufnahme
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Sonde auf der Oberfläche immobilis
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Stromdichte / µA/mm² 0.40 0.30 0.
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Targets mit den Sonden auf einem Fa
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60 °C gefunden wurde. Diese beiden
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Wie zu erkennen ist, ist nur nach d
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Für die Untersuchung des Einflusse
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Abb. 7.3 : Schematische Darstellung
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Anhang Abbildungsverzeichnis Abb. 3
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Abb. 5.14: ACV-Peak von 80 nM Ferro
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Literatur 1 Hershey, A.D.; Chase, M
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30 Hinnen, C.; Rousseau, A.; Parson
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55 Zhu, N.; Zhang, A.; Wang, Q.; He
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