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Tratado de Fibrosis Quística
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El descubrimiento de la técnica de PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) ha supuesto toda una revolución
en el campo de la genética molecular, permitiendo
disponer de múltiples copias de genes o fragmentos
génicos. La PCR permite que los estudios de RFLP(s)
sean más fiables y más fáciles. La técnica consiste en la
síntesis in vitro de una región concreta de ADN gracias
a la utilización de unos pequeños fragmentos de ADN
de cadena simple de secuencia conocida y complementaria
a los extremos de la región que queremos amplificar
(cebadores o primers). Se basa en la repetición
de ciclos que consisten en la desnaturalización del ADN
molde, la hibridación de los cebadores con el molde y la
síntesis de la cadena complementaria mediante la acción
de la enzima ADN-polimerasa. Si se realizan 20 o
30 ciclos del proceso, se pueden obtener varios millones
de copias de la secuencia de interés, flanqueada por
los cebadores utilizados en la amplificación (Fig. 6). Una
figura 6
Esquema del principio de la PCR. El ADN se somete a varios ciclos de desnaturalización,
hibridación y elongación, en presencia de nucleótidos libres, primers
y enzima Taq DNA-polimerasa.
de las aplicaciones de la PCR es precisamente la detección de polimorfismos a nivel de ADN mediante la digestión
de los productos de PCR con enzimas de restricción y el análisis del tamaño de los fragmentos generados mediante
electroforesis (PCR/RFLP). Actualmente, el desarrollo de las nuevas tecnologías del ADN permite detectar estos
polimorfismos mediante técnicas como las curvas de fusión.
EL CLONAJE DE UN GEN
El clonaje molecular consiste en la obtención de fragmentos de ADN independientes, en cantidad suficientemente
grande para que permita su estudio. Se realiza introduciendo los fragmentos de ADN en un vector de clonaje (un
plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial de levadura) y amplificándolos posteriormente en
el interior de una bacteria o una levadura.
El ADN a clonar se digiere con enzimas de restricción
apropiadas. El vector que se utilizará depende del tamaño
de los fragmentos que se quieran clonar. Los
plásmidos con grandes inserciones de ADN extraño
suelen ser inestables y normalmente se utilizan para
insertos de hasta 5 kilobases (5.000 pares de bases),
los bacteriófagos pueden incorporar hasta 20 Kb(s),
los cósmidos permiten clonar fragmentos de entre 35
y 45 Kb(s). Los cromosomas artificiales de levadura
(YAC, del inglés yeast artificial chromosome) se utilizan
para clonar hasta 1.000 Kb(s) de ADN. Una vez digerido
el ADN, se mezcla con el del vector con la finalidad
de que se unan; luego se trata con ADN-ligasa para establecer
enlaces covalentes que estabilicen la molécula
quimérica (Fig. 7). Posteriormente, se introduce en una
bacteria (Escherichia coli), un bacteriófago (fago λ) o
una levadura (Saccharomices cerevisiae), según el vector
utilizado.
figura 7
Esquema de la obtención de una librería y selección de clones que incluyen
el marcador utilizado para rastrearla.