2. Material und Methoden - ArchiMeD

3.2.3.3 Isolierung eines homologen Maus-Gens mfc34
ERGEBNISSE
Wie bereits erwähnt zeigt Efc34 im 5´-Bereich auf Nukleotidebene eine 81%ige Identität, auf
Aminosäureebene eine 57%ige Identität zu einem Maus-EST (Accession Nr.: Z78160).
Z78160 wurde aus einer Maus Cochlea-cDNA-Bibliothek isoliert und nicht weiter
charakterisiert (Crozet et al., 1997). Im folgenden wird die Isolierung des murinen homologen
Maus-Gen (mfc34) beschrieben. Von der Maussequenz Z78160 wurden die spezifischen
Primer mfc1F und mfc1R synthetisiert. Durch PCR mit fetaler Maus-cDNA (E11,5) als
Matrize wurde ein PCR-Produkt hergestellt, welches in einer Plaquefilterhybridisierung (siehe
2.8.3) gegen eine fetale Maus-cDNA-Bibliothek (E7, Clontech, Palo Alto, USA) als Sonde
eingesetzt wurde. Mit dieser Sonde konnten acht positive Einzelphagen isoliert werden (FM1
– FM8). Durch PCR mit der Primerkombination mfc1F/mfc1R wurden die Klone FM1, FM3,
FM5, FM6, FM7 und FM8 als positiv identifiziert und weiter analysiert. Die Phagen-Integrate
wurden mittels „Expand“-PCR mit den Primern λgt10 und λgt11 amplifiziert und in den T-
Vektor umkloniert (siehe 2.4.1). Die Insertgröße der zu untersuchenden Klone lag zwischen
1,7 kBp und 3 kBp. Die in T-Vektor umklonierten Integrate wurden mit den Primern T3A und
T7A, sowie spezifischen Primern doppelsträngig sequenziert. In Abb. 28 sind die sechs
untersuchten Fragmente und die daraus resultierenden Konsensussequenzen dargestellt. Wie
aus Abb. 28 hervorgeht zeigt der Klon FM3 in seinem 5`-Bereich (1208 Bp) keine
Übereinstimmung zu den übrigen isolierten Klonen.
Ein Homologievergleich der Konsensussequenz mit der NCBI-EST-Datenbank zeigt auf
Nukleotidebene deutliche Homologie (86%) der ersten 253 Bp der Klone FM5, FM6 und FM7
zu den Basen 1-117 eines EST-Klons (Accession Nr.: Z19242). Der 3´-Bereich (nt118-323)
desselben EST-Klons ist homolog (93%) zu den ersten 207 Bp des Klons FM3. Wie in
Abbildung 28 angedeutet, stellt somit der EST-Klon Z19242 eine Überlappung zwischen dem
Klon FM3 und den Klonen FM5, FM6 und FM7 her. Die ersten 1208 Bp von FM3 stellen
wahrscheinlich ein alternativ gespleißtes Exon dar, welches in den übrigen Klonen nicht
vorhanden ist. Dieser Abschnitt ist in Abb. 28 bei Klon FM3 farbig unterlegt.
Zwei weitere Bereiche konnten ebenfalls nach genauer Analyse als alternativ gespleißte Exons
identifiziert werden. Es handelt sich dabei um deutlich kürzere Sequenzabschnitte von 69 Bp
bzw. 99 Bp. Die Klone FM3 und FM7 beinhalten diese Exons, der Klon FM1 jedoch nicht.
Die Bereiche sind in Abb. 30 unterstrichen.
Da die bisher ermittelte Sequenz weder ein Polyadenylierungssignal noch eine poly(A)-
Sequenz besitzt, wurde eine weitere am 3´-Ende liegende Sonde über PCR hergestellt und die
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