2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.2 Isolierung von RNA
2.2.1 Isolierung von RNA aus Zellen
MATERIAL UND METHODEN
Die Präparation von Gesamt-RNA aus Zellen erfolgte mit Hilfe des Qiagen total RNA Mini-
Kits (Qiagen, Hilden).
Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit 1x Trypsin-EDTA Lösung (Sigma, Deisenhofen)
wurden diese ohne Medium 5 min bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend konnten die
Zellen mit 25 ml PBS abgewaschen werden. Nach 15 minütiger Zentrifugation (1200 Upm,
4°C) wurde das Zellpellet in 1,9 ml Puffer RLT aufgenommen und durch Homogenisierung
konnten die Zellen aufgebrochen werden. Die weitere Aufarbeitung der RNA erfolgte nach
den Angaben des Herstellers.
2.2.2 Isolierung von RNA aus Gewebe
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenen Geweben erfolgte je nach Gewebemenge
mit dem QIAGEN RNeasy Mini RNA Kit (Qiagen, Hilden) oder mit dem QIAGEN RNeasy
Midi-Kit (Qiagen, Hilden). Die Präparation erfolgte nach den Vorschriften des Herstellers.
Alle Lösungen, die bei Arbeiten mit RNA verwendet wurden, wurden vor Gebrauch mit 0,2%
DEPC-H2O versetzt und anschließend autoklaviert.
2.2.3 DNase I-Behandlung
Da eine Verunreinigung der isolierten RNA mit DNA in nachfolgenden Reaktionen stört,
wurde die RNA mit DNase I behandelt. DNase I ist eine unspezifische Endonuklease, die
einzel- und doppelsträngige DNA zu Oligodesoxyribonukleotiden mit einem 5´-Phosphat
abbaut. In Anwesenheit von Mg 2+ wird nur ein Strang der DNA hydrolysiert und auf diese
Weise werden Einzelstrangbrüche gebildet.
Die Inkubation der RNA erfolgte in einem Reaktionspuffer bestehend aus 1x TE-Puffer,
10 mM MgCl2, 1mM DTT mit 10-30 Units RNase-Inhibitor (MBI Fermentas, St. Leon Rot)
und 10-30 U DNase I (RNase frei) (Boehringer, Mannheim) für 2 Stunden bei 37°C. Durch
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