2. Material und Methoden - ArchiMeD

DISKUSSION
Datenbank veröffentlichen Klone in der Regel nur einzelsträngig sequenziert und nicht editiert
werden, kann von einer Lesegenauigkeit von etwa 97% ausgegangen werden (Hillier et al.,
1996). Da für die Synthese der verwendeten cDNA-Bibliotheken zumeist Oligo-dT-Priming
verwendet wird, stellen etwa 65% der veröffentlichten EST-Sequenzen das 3´-Ende und somit
größtenteils untranslatierten Bereich der cDNAs dar, nur 26% repräsentieren das 5`-Ende.
Daher gibt es ein verstärktes Bestreben von zahlreichen öffentlichen, aber auch privaten
Organisationen, alle exprimierten Gene zu identifizieren und durch Etablierung neuer
Methoden der cDNA-Bibliothek Synthese „volle Länge“-cDNAs zu isolieren und in die
entsprechenden EST-Projekte einzubinden (Neto et al., 2000).
Zu (2): Die cDNA-Mikroarray Hybridisierung ist eine Hochdurchsatzmethode, bei der eine
sehr große Anzahl von cDNA-Sequenzen auf einen Glass-Objektträger immobilisiert werden.
Durch eine anschließende Hybridisierung mit unterschiedlichen RNAs kann die differenzielle
Expression verifiziert bzw. untersucht werden (Schena et al., 1995). Es handelt sich um eine
Methode, die sich häufig an ein EST-Projekt anschliesst, da neben cDNA-Sequenzen auch
Oligonukleotide auf Objektträgern immobilisiert und untersucht werden können (Lockhart et
al., 1996). Limitierender Faktor der Methode ist, dass nur die Gene untersucht werden können,
deren Sequenz bekannt sind. Jedoch wird durch den schnellen Fortschritt des humanen
Genomprojekts auch dieses Problem wahrscheinlich überwunden. Besonderer Vorteil dieser
Methode ist, dass durch Herstellung mehrere Objektträger der gleiche Satz von Genen unter
verschiedenen experimentellen Bedingungen und mit verschiedenen Sonden untersucht
werden kann. Heller und Mitarbeiter (1997) konnten durch Hybridisierung mit RNA, isoliert
aus kultivierten Makrophagen, Chondrozyten und arthrotischem Gewebe die Beteiligung von
IL3 an rheumatischer Arthrose nachweisen.
Ein am ”National Institute of Health” initiiertes ”Skeletal genome anatomy project” (SGAP)
plant durch Anordnung von 5000 cDNAs bzw. EST-Sequenzen auf einem Chip, das
Expressionsmuster der Gene durch Hybridisierung mit verschiedenen Knorpel- bzw.
Knochengewebe-RNAs zu untersuchen. Ergebnisse, die dieses Projekt betreffen, sind jedoch
noch nicht publiziert. Ein ähnlicher Microarray-Ansatz ist auch mit Maus-ESTs geplant
(http://www.lsc.pku.edu.cn/meeting/abstract/33t.html).
Zu (3): Der von Liang und Pardee (1992) entwickelte Methode des “Differential Display”
liegt die Idee zugrunde, die RNA-Profile mehrerer Zellpopulationen mittels Gelelektrophorese
miteinander zu vergleichen. Dazu werden Subpopulationen der RNA der zu untersuchenden
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