2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
Transilluminator betrachtet und mit dem E.A.S.Y. Videosystem (Herolab, Wiesloch)
dokumentiert.
2.3.3 Wiedergewinnung von DNA aus Agarosegelen
Nach gelelektrophoretischer Trennung wurden die Ethidiumbromid-gefärbten Banden auf
einem Transilluminator aus dem Gel ausgeschnitten. Die Isolation der Fragmente aus dem Gel
erfolgte mit Hilfe des “QIAquick Gel Extraction Kit” der Firma Qiagen (Hilden) entsprechend
den Anweisungen des Herstellers.
2.3.4 Fällung von DNA
Wenn nicht anders beschrieben, wurde die DNA durch Zusatz von 1/10 Volumen 3M
NaAcetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol abs. gefällt. Nach 30-minütiger Zentrifugation
bei 13000 Upm wurde das DNA-Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, erneut für 15 min
zentrifugiert und anschließend vakuumgetrocknet. Alle Zentrifugationsschritte wurden bei
Raumtemperatur durchgeführt.
2.3.5. Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung von kleinen PCR-Fragmenten wurden vertikale Polyacrylamidgele
verwendet. Die Acrylamidkonzentration variierte ja nach Größe der zu untersuchenden
Fragmente und lag zwischen 6% - 20%. Als Laufpuffer diente 1x TAE-Puffer. Die
gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 120 - 200 V. Als Marker wurden 25 bp bzw.
100 bp Marker (Boehringer, Mannheim) verwendet. Im Anschluß an die Auftrennung wurden
die Polyacrylamid-Gele mit 1x SYBR-Green (Biozym, Oldendorf) 15 min gefärbt und direkt
auf einem Transilluminator ausgewertet.
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