2. Material und Methoden - ArchiMeD

1
Abb. 8A
1000 Bp
2
C F UF3 XR1 Pub1 Pub2 Q U2
5336 Bp
3
4
2229 Bp
635 Bp
5
1043 Bp
6
781 Bp
7
715 Bp
8
1477 Bp
9
1135 Bp
492 Bp
Abb. 8B
ERGEBNISSE
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M´
Abb. 8: PCR-Strategie zur Ermittlung der Exon/Intron-Struktur des humanen FGFR3-Gen.
(A) Schematische Darstellung der Primerkombinationen, die zur Ermittlung der genomischen Struktur des
FGFR3-Gens verwendet wurden.
(B) Gelelektrophoretische Auftrennung der neun generierten PCR-Produkte.
Die Spuren 1-9 entsprechen den in Abb. 8A abgebildeten Fragmenten 1–9. Als
Molekulargewichtsstandard wurde Hind-III verdaute λ-DNA (M) bzw. 100 Bp-Leiter (M´) verwendet.
Bei der Aufklärung der Exon/Intron-Struktur des FGFR1-Gens war es Johnson et al. (1991)
nicht möglich, den 5´ Bereich des Gens auf genomischer Ebene zu amplifizieren. Sie gingen
von einem oder mehreren sehr großen Introns in diesem Bereich aus. Daher wurde in der
vorliegenden Arbeit mit der Primerkombination UF1/C1 eine “Expand”-PCR durchgeführt.
Auf cDNA-Ebene entsteht mit dieser Primerkombination ein 124 Bp-Fragment. Die
Amplifikation mit der Primerkombination und pC385.1-Cosmid-DNA als Matrize ergab ein 5
kBp-Fragment. Zur doppelsträngigen Sequenzierung dieses PCR-Produkts wurde eine “shot-
gun”-Klonierung von Rsa I- und Hae III-Restriktionsfragmenten durchgeführt. Restliche, nur
einzelsträngig sequenzierte Bereiche wurden mit spezifischen Primern doppelsträngig
sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen ergab, dass das 5 kBp-Fragment lediglich ein
Intron (Intron 2) umspannt, dessen Größe 5210 Bp beträgt. Die PCR (siehe 2.5) mit der
Primerkombination C/F und pC385.1-Cosmid-DNA als Matrize ergab ein 2,2 kBp-Fragment.
Durch “shot-gun”-Klonierung von Rsa I- und Hae III-Restriktionsfragmenten konnte eine fast
vollständige doppelsträngige Sequenzierung erreicht werden. Restliche, einzelsträngige
Bereiche wurden auch hier mit spezifischen Primern doppelsträngig sequenziert. Die
23130
9416
6558
4361
2322
2027
564
Bp
1000
500
Bp
49