2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.7 Radioaktive bzw. nicht-radioaktive Markierungstechniken
MATERIAL UND METHODEN
2.7.1 Radioaktive DNA Markierung durch “Random primed oligo labeling”
Die radioaktive Markierung doppelsträngiger DNA erfolgte nach der von Feinberg und
Vogelstein (1983) entwickelten “random primed oligo labeling” Technik. Für eine
Markierung wurden 2 - 5 ng denaturierte Sonden-DNA, 30 µCi[α- 32 P] dCTP (Amersham,
Braunschweig), 6 µl „Oligolabelingbuffer“ (OLB), 60 µg BSA, 3 U Klenow-DNA-
Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) in einem 30 µl Ansatz für 2 - 4 h bei 37°C
inkubiert. Zur spezifischen Markierung von PCR-Produkten wurde anstelle der Hexamere
0,6 µM entsprechende PCR-Primer in die Reaktion eingesetzt. Nicht eingebaute Nukleotide
wurden über Sephadex G-50-Säulen (MicroSpin TM G-50 Columns, Pharmacia) von der
markierten DNA getrennt.
2.7.2 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden mit S 35 für die in situ-
Hybridisierung
Die Herstellung radioaktiv markierter Oligonukleotide (42 – 45 bp) erfolgte mit Hilfe der
Terminalen Desoxynucleotidyltransferase (TdT), die matrizenunabhängig Nukleotide an die
3´OH-Enden doppel- oder einzelsträngiger DNA–Moleküle anhängt.
Pro Reaktion wurden 80 ng Oligonukleotid, 5 µl 5x Cobolt Puffer (Gibco BRL, Eggenstein),
12 µl α- 35 S-dATP (DuPont, NEN, USA), 20 U TdT (Takara, Amersham) für 1 Stunde bei
37°C inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden über Nensorb 20-Säulen (DuPont, NEN,
USA) von den markierten Oligonukleotiden getrennt.
2.7.3 Nick-Translation
Die Markierung von restringierter PAC-DNA für die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
wurde mit Hilfe des „Nick-Translations-Kits“ (Boehringer, Mannheim) nach der Methode von
Macgregor und Mizuno (1976) durchgeführt. Es wurde ca. 1 µg Sonden-DNA gemäß den
Herstellerangaben markiert. Der Ansatz wurde im Anschluß wie unter 2.3.4 beschrieben
gefällt.
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