2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
2.8.6 Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) an Chromosomenpräparaten
Die chromosomale Lokalisation des humanen MINT-Gens wurde mit Hilfe der Fluoreszenz-in
situ-Hybridisierung nach Seipel (1996) ermittelt. Dazu wurden Metaphasen von menschlichen
Lymphozyten nach der Methode von Lemieux (1992) präpariert. Als Hybridisierungssonde
diente PstI-restringierte PAC-DNA, die zuvor über Nicktranslation mit Digoxygenin 11-dUTP
(Boehringer, Mannheim) markiert wurde (vgl. 2.7.3). Die in Anwesenheit von Cot-1 DNA
(GibcoBRL, Karlsruhe) und einzelsträngiger Lachs-Sperma-DNA mit Ethanol gefällte DNA
wurde in 50% Formamid und 2x SSC resuspendiert. Nach Denaturierung der DNA bei 75°C
(10 min) wurde die Sonde zur Absättigung repetitiver Sequenzen 15 min bei 37°C inkubiert.
Die Hybridisierung erfolgte sofort im Anschluss bei 37°C (16 Stunden) auf nach Klever et al.
(1981) denaturierten Chromosomenpräparaten. Danach wurden die Objektträger dreimal
6 min in 50% Formamid, 2x SSC (42°C), einmal 6 min in 2x SSC (42°C) und einmal
6 min in 0,1x SSC bei 60°C gewaschen. Es folgte eine weitere Inkubation für 20 min bei 37°C
in 5% BSA, 0,1% Tween, 4x SSC. Wie von Lichter et al. (1988) beschrieben erfolgte die
Detektion der Sonde mit einem monoklonalen anti-Dig-Antikörper (Maus, Sigma), TRITC-
markiertem anti-Maus IgG-Antikörper (Kaninchen, Sigma) und TRITC-markiertem anti-
Kaninchen IgG-Antikörper (Ziege, Sigma) zur Verstärkung. Zur Dokumentation wurden die
Chromosomenpräparate mit DAPI (Boehringer, Mannheim) gegengefärbt und in einem
speziellen Medium (Vector Laboratories, USA) eingebettet. Die Analyse der Bilder wurde mit
einem Leica (Bensheim) DMRBE Fluoreszenez-Mikroskop (100x/1.30 Fluotar
Ölimmersions-Objektiv) durchgeführt. Dokumentiert wurden die Bilder mit einer CCD-
Kamera und einem assoziierten Computer-Software Paket (Applied Imaging, USA).
2.9 Herstellung der humanen Chondrocyten-cDNA-Bank
Die humane Chondrocyten-cDNA-Bank wurden von B. Lee et al. (Houston) hergestellt.
Ausgangsmaterial war humanes Knorpelgewebe (20. Schwangerschaftswoche bis 2.
Lebensjahr). Die Herstellung erfolgte unter Verwendung eines ZAP-cDNA Synthese-Kits
(Stratagene, Heidelberg), der auf der Methode von Gubler und Hoffmann (1983) basiert.
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