2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
MATERIAL UND METHODEN
Die PCR (Saiki et al., 1988) wurde in 20 - 100 µl Ansätzen durchgeführt. In der Regel wurden
50 - 100 ng DNA pro PCR-Reaktion eingesetzt. Der Reaktionsansatz setzte sich wie folgt
zusammen: 40 mM KCl, 10mM Tris/HCl (pH 8,3), 0,1 mg/ml Gelatine, 1,5 mM MgCl2,
je 1 µM der beiden Primer, je 200 mM der vier dNTPs sowie 1 U Taq-Polymerase (Perkin
Elmer Cetus, USA). Ausgehend von einem Standardprogramm (1 min 94°C, 1 min 58°C, 1
min 72°C, 35 Zyklen) variierten die Amplifikationsbedingungen je nach verwendeter
Primerkombination und Matrizen-DNA. Eine initiale 4-minütige Denaturierung und eine
abschließende Inkubation bei 72°C für 7 min waren konstant. Die PCR-Reaktion erfolgte
entweder in einem TC-1-Gerät (Perkin-Elmer, Weiterstadt) oder in einem PTC-100-Gerät
(MJ-Research, USA).
Zur Überprüfung der Amplifikation wurde 1/10 Volumen der PCR-Reaktion auf einem
1 - 2%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.
2.6 Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
Zur Amplifikation spezifischer cDNA-Fragmente aus RNA wurden diese zunächst mit Hilfe
der MMLV-Reversen Transkriptase (GibcoBRL, Karlsruhe) in einen DNA-Einzelstrang
überführt. Dazu wurden 4 µg RNA in einem Gesamtvolumen von 16 µl DEPC-H2O für
10 min bei 70°C denaturiert. Nach Zugabe von 6,25 µM Oligo(dT)15-Primer, 100 U RNase
Inhibitor (MBI Fermentas, St.Leon-Rot), 10 mM DTT, 0,9 mM dNTPs, 1x Reaktionspuffer
(GibcoBRL, Karlsruhe) und 300 U MMLV-Reverse Transkriptase wurde der Ansatz für
90 min bei 37°C inkubiert. Durch 10-minütiges Erhitzen auf 95°C wurde die Reverse
Transkriptase inaktiviert.
Für die anschließende PCR wurde in der Regel 2 µl cDNA als Template mit genspezifischen
Primern verwendet.
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